I.- EL MICROSCOPIO
II.- MICROSCOPIO OPTICO
III.- MICROSCOPIO ELECTRONICO
IV.- MICROSCOPIA OPTICA
El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen
de un objeto pequeño. Es el instrumento que más se usa en
los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de
lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto
microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de
miles de veces el tamaño original.
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico.
En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando
un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto
y los ojos. El microscopio electrónico utiliza un rayo de electrones
controlado por un campo magnético.
Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000
veces el tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000
veces.
Las lentes de un microscopio óptico son el condensador, el objetivo
y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación
y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador
puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición
que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto
que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente
objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento
final.
Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están
equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión.
Estos objetivos están montados sobre una pieza que se llama revolver
que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador.
La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular.
El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento
de su objetivo y de su ocular. El microscopio compuesto es capaz de conseguir
aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una
sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se usa principalmente
como lupas y cristales de aumento.
Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es
su poder resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados
dos puntos muy cercanos. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será
la definición de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo
son especialmente buenos para ver pequeñas estructuras. El poder
resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada
y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica.
Como los microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de
onda está fijada y es por lo que la resolución de un objeto
es función de la apertura numérica; cuanto mayor sea la apertura,
el objeto resuelto será más pequeño.
0.5 l d = ----------- N sen a
Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en
lugar de la luz, lo que les permite tener un poder de resolución
muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005
- 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750 nm;
violeta - rojo). Es posible con el microscopio electrónico resolver
objetos separados por una distancia de 0,003 µm, comparado con los
0,25 µm de uno óptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un
millón de veces.
A causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse
objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para
ser observada directamente. Por lo que, para preparar muestras para el microscopio
electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos.
Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas
(etanol o acetona). Después de la deshidratación, la muestra
se incluye en una resina y es aquí donde se realizan cortes finos
con un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante.
Una sola célula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones
muy finas. Si sólo tiene que observarse el contorno de un organismo,
no son necesarias secciones finas por lo que se montan células enteras
que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El rayo de electrones
es dirigido sobre la preparación y los electrones dispersados por
el metal pesado activan una pantalla de observación produciendo una
imagen. A la primera técnica se la denomina Microscopía Electrónica
de Transmisión (MET) y a la segunda Microscopía Electrónica
de Barrido (MEB).
Además del microscopio de campo claro existen otros microscopios
ópticos como son el de campo oscuro, fluorescencia y contraste de
fases.
Microscopio de campo claro: usa como fuente de luz directa bien una
bombilla bien la luz solar. Ya que los microorganismos son transparentes
es difícil distinguirlos con este tipo de microscopía y es
por lo que se suelen teñir.
Microscopio de campo oscuro: usa un microscopio óptico equipado
con un condensador y objetivo especial que iluminan los microorganismos
en la muestra frente a un fondo oscuro. Este método se utiliza para
visualizar microorganismos vivos sin teñir.
Microscopio de fluorescencia: la muestra se tiñe con una sustancia
fluorescente que absorbe la energía de las ondas cortas de la luz
(azul) y emite la luz de longitudes de ondas más largas (verde).
Se utiliza en inmunofluorescencia, técnica en la cual una sustancia
fluorescente se une a un anticuerpo específico de ciertos microorganismos.
Si el anticuerpo fluorescente se une al microorganismo, este microorganismo
emite fluorescencia y se puede identificar. Esta técnica se usa en
clínica.
Microscopio de contraste de fases: es un microscopio óptico
modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad.
Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminación
de tal manera que vaya en diferentes rutas a través de las distintas
partes de una célula. El resultado es una imagen con diferentes grados
de brillo y oscuridad. Con este método, el material denso aparece
brillante, mientras que las partes de la célula que tienen una densidad
cercana al H2O (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar
estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.
Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante
microscopios ópticos, por lo que nos vamos a limitar a describir
las técnicas más comunmente usadas para realizar preparaciones
para microscopios ópticos.
Preparación en fresco: para poder observar la movilidad de
un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en suspender
una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubriéndola,
sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al microscopio
de contraste de fases.
Técnicas de tinción:
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes
etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y
observación.
1.- Extensión: se realiza sobre un portaobjetos que ha de
estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente
y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de
H2O.
2.- Fijación: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos
y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del
colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente
a 10 cm de la llama del mechero.
3.- Tinción: se realiza añadiendo los colorantes sobre
los microorganismos sometidos a los procesos anteriores. Puede ser de varios
tipos:
Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino
el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende
sobre una gota del colorante (nigrosina).
Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo.
Al igual que la tinción negativa, sólo nos permite observar
la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.
Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia
una estructura. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente
al del primero, denominándose colorante de contraste.
Tinción de Gram
Es la técnica de tinción diferencial más importante
que se utiliza en bacterias. El primero en describirla fue el danés
Christian Gram. Consiste básicamente en añadir lo siguiente:
Cristal violeta (colorante azul)
Lugol (mordiente, sustancia no colorante que refuerza la acción de
un colorante)
Etanol 96° (decolorante que remueve el colorante de ciertas bacterias)
Safranina (colorante de contraste, rojo)
Esta tinción distingue entre dos amplios grupos de bacterias según
la composición de la pared celular; las Gram (-) que no retienen
el complejo cristal violeta-lugol después de la decoloración
con alcohol y aparecen teñidas de rojo, y las Gram (+) que sí
lo retienen y aparecen teñidas de azul oscuro.