Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia.
Universidad de Salamanca
1.- Altas TemperaturasA.- Esterilización por calor húmedo
B.- Esterilización por calor seco
- Autoclave
- Tindalización
- Pasteurización
V.- AGENTES ESTERILIZANTES QUIMICOS2.- Bajas Temperaturas
- Horno Pasteur
- Incineración
3.- RadiacionesA.- Radiaciones ionizantes4.- Filtración
B.- Radiaciones no ionizantesA.- Filtros de membrana5.- Desecación
B.- Filtros HEPA
1.- Oxido de etilenoVI.- DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS
2.- Glutaraldehido
A.- InorgánicosVII.- EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS1.- MetalesB.- Orgánicos
2.- Acidos y álcalis
3.- Compuestos inorgánicos oxidantes
4.- Halógenos1.- Alcoholes
2.- Fenol y compuestos fenólicos
1.- Técnica de dilución en tubo
2.- Técnica de la placa de agar
3.- Técnica del coeficiente fenólico
Esterilización: eliminación de toda forma de vida,
incluídas las esporas.
Desinfección: proceso de destruir los agentes infecciosos.
Antisepsia: operaciones o técnicas encaminadas a crear un
ambiente que impida el desarrollo de los microorganismos e incluso pueda
matarlos.
Asepsia: técnicas empleadas para impedir el acceso de microorganismos
al campo de trabajo.
Antibiosis: fenómeno biológico en el que existe una
detención o destrucción del crecimiento microbiano debido
a sustancias producidas por otro ser vivo.
Antimicrobianos: sustancias que matan o inhiben el crecimiento de
los microorganismos (antibacterianos, antifúngicos, etc.).
Microbicidas: sustancias que matan las formas vegetativas, pero no
necesariamente las esporas de un microorganismo (bactericida, fungicida,
etc.).
Microbiostáticos: sustancias que inhiben el crecimiento de
microorganismos (bacteriostáticos, fungistáticos, etc.).
Antisépticos: se refiere a sustancias que se aplican sobre
el cuerpo.
Desinfectantes: se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.
Agentes terapéuticos: antimicrobianos empleados en el tratamiento
de infecciones.
Agentes quimioterapéuticos: sustancias químicas empleadas
en el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades causadas por
la proliferación de células malignas.
Antibióticos: sustancias producidas por un ser vivo que se
oponen a la vida de otro ser vivo.
Criterio de muerte de un microorganismo: pérdida irreversible
de la capacidad de reproducción en un medio adecuado. Para poder
determinar la eficacia antimicrobiana (la muerte de los microorganismos)
se utilizan técnicas que descubran a los sobrevivientes es decir,
a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de reproducirse están
muertos. Esto se determina generalmente mediante métodos cuantitativos
de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque forman
colonias.
Cuando una población microbiana se expone a un agente letal, la cinética
de la muerte es casi siempre exponencial ya que el número de supervivientes
disminuye de forma geométrica con el tiempo. Si representamos gráficamente
el logaritmo del número de supervivientes frente al tiempo se obtiene
una línea recta cuya pendiente negativa define la tasa de mortalidad.
Esta tasa de mortalidad nos dice sólamente que fracción de
la población inicial sobrevive a un determinado período de
tratamiento. Para determinar el número real de sobrevivientes es
necesario conocer además el tamaño inicial de la población.
De acuerdo con esto, para establecer los procedimientos de esterilización
hay que tener en consideración dos factores: la tasa de mortalidad
y el tamaño de la población inicial. En la práctica
de la esterilización la población microbiana que ha de ser
destruida es mixta. Como los microorganismos difieren ampliamente en su
resistencia a los agentes letales, los factores que se hacen significativos
son el tamaño de la población inicial y la tasa de mortalidad
de los miembros más resistentes de la población mixta. Para
asegurar la fiabilidad de los métodos de esterilización se
utilizan suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos
rutinarios de esterilización se diseñan siempre de forma que
proporcionen un amplio margen de seguridad.
Temperatura: a mayor temperatura mayor acción.
Tipo de microorganismo: las células vegetativas en desarrollo
son mucho más susceptibles que las esporas.
Estado fisiológico de las células: las células
jóvenes son más vulnerables que las viejas.
Ambiente:
La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de
los métodos más efectivos para destruir microorganismos. Hay
que distinguir entre calor húmedo y calor seco. El húmedo
mata los microorganismos porque coagula sus proteínas siendo más
rápido y efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus
constituyentes químicos. La acción letal del calor es una
relación de temperatura y tiempo afectada por muchas condiciones.
Por ejemplo, las esporas de Clostridium botulinum son destruidas en 4 a
20 minutos a 120° C en calor húmedo, mientras que se necesitan
alrededor de 2 horas de exposición al calor seco para obtener los
mismos resultados.
A.- Esterilización por calor húmedo: (se utiliza para
soluciones acuosas)
Autoclave: El calor en la forma de vapor a saturación y a
presión es el agente más práctico para esterilizar
ya que el vapor a presión proporciona temperaturas superiores a las
que se obtienen por ebullición. El aparato utilizado se llama autoclave
(una olla que regula la presión interna y el tiempo). Los autoclaves
de laboratorio se emplean generalmente a una presión de vapor de
una atmósfera por encima de la presión atmosférica
lo cual corresponde a una temperatura de 120° C. El tiempo de exposición
depende del volumen del líquido, de tal manera que para volúmenes
pequeños (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120°
C; si los volúmenes son mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento.
Algunos materiales no se deben esterilizar en el autoclave. Sustancias que
no se mezclan con el agua no pueden ser alcanzadas por el vapor sobreviviendo
los microorganismos que contengan. Otras sustancias se alteran o son destruidas
por tratamientos prolongados de calor empleándose en estos casos
otros métodos de esterilización.
Tindalización: Se utiliza cuando las sustancias químicas
no pueden calentarse por encima de 100° C sin que resulten dañadas.
Consiste en el calentamiento del material de 80 a 100° C hasta 1 hora
durante 3 días con sucesivos períodos de incubación.
Las esporas resistentes germinarán durante los períodos de
incubación y en la siguiente exposición al calor las células
vegetativas son destruidas.
Pasteurización: La leche, nata y ciertas bebidas alcohólicas
(cerveza y vino) se someten a tratamientos de calor controlado que sólo
matan a ciertos tipos de microorganismos pero no a todos. La leche pasteurizada
no es estéril. La temperatura seleccionada para la pasteurización
se basa en el tiempo térmico mortal de microorganismos patógenos
(es el tiempo más corto necesario para matar una suspensión
de bacterias a una temperatura determinada). Mycobacterium tuberculosis
es de los microorganismos patógenos más resistentes al calor
que puede transmitirse por la leche cruda y se destruye en 15 minutos a
60° C. Posteriormente se descubrió que Coxiella burnetti, agente
causal de la fiebre Q, se encuentra a veces en la leche y es más
resistente al calor que Mycobacterium tuberculosis por lo que la pasteurización
de la leche se realiza a 62,8° C durante 30 minutos o a una temperatura
ligeramente superior, 71,7° C durante 15 segundos (Flash-Pasteurización).
B.- Esterilización por calor seco: (se utiliza para materiales
sólidos estables al calor)
Horno Pasteur: El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar
material de vidrio y otros materiales sólidos estables al calor.
El aparato que se emplea es el horno Pasteur. Para el material de vidrio
de laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposición
a 160° C.
Incineración: La destrucción de los microorganismos
por incineración es una práctica rutinaria en los laboratorios.
Las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros Bunsen. La incineración
también se utiliza en la eliminación de residuos hospitalarios.
En general, el metabolismo de las bacterias está inhibido a temperaturas
por debajo de 0° C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los microorganismos
sino que pueden conservarlos durante largos períodos de tiempo. Esta
circunstancia es aprovechada por los microbiólogos para conservar
los microorganismos indefinidamente. Los cultivos de microorganismos se
conservan congelados a -70° C o incluso mejor en tanques de nitrógeno
líquido a -196° C.
A.- Radiaciones ionizantes
Rayos gamma: Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son
emitidas por ciertos isótopos radiactivos como es el Co60 pero son
difíciles de controlar ya que este isótopo emite constantemente
los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma pueden penetrar
los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y después
esterilizar.
Rayos catódicos (Radiación con haz de electrones):
Se usan para esterilizar material quirúrgico, medicamentos y otros
materiales. Una ventaja es que el material se puede esterilizar después
de empacado (ya que éstas radiaciones penetran las envolturas) y
a la temperatura ambiente.
B.- Radiaciones no ionizantes
Luz ultravioleta: La porción ultravioleta del espectro incluye
todas las radiaciones desde 15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor
de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295
nm). Se usan para reducir la población microbiana en quirófanos,
cuartos de llenado asépticos en la industria farmacéutica
y para tratar superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche.
La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que sólo
los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que
se exponen directamente a la acción de la luz UV son susceptibles
de ser destruídos.
Algunos materiales como los líquidos biológicos (suero
de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos)
son termolábiles. Otros agentes físicos como las radiaciones
son perjudiciales para estos materiales e imprácticos para esterilizarlos,
por lo que se recurre a la filtración a través de filtros
capaces de retener los microorganismos. Los microorganismos quedan retenidos
en parte por el pequeño tamaño de los poros del filtro y en
parte por adsorción a las paredes del poro durante su paso a través
del filtro debido a la carga eléctrica del filtro y de los microorganismos.
Debido al pequeño tamaño de los virus, nunca es posible tener
certeza de que, por los métodos de filtración que dejan libre
de bacterias una solución, se van a eliminar también los virus.
A.- Filtros de membrana
Los filtros de membranas son discos de ésteres de celulosa con poros
tan pequeños que previenen el paso de los microorganismos. Existen
distintos tipos de filtro dependiendo del tamaño de poro. Estos filtros
son desechables. Además de utilizarse en la esterilización
de líquidos se usan en el análisis microbiológico de
aguas ya que concentran los microorganismos existentes en grandes volúmenes
de agua.
B.- Filtros HEPA
Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) está compuesto por
pliegues de acetato de celulosa que retienen las partículas (incluídos
los microorganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.
La desecación de las células vegetativas microbianas paraliza
su actividad metabólica. Este proceso físico se utilizaba
ampliamente antes del desarrollo de la refrigeración. El tiempo de
supervivencia de los microorganismos después de desecados depende
de muchos factores, entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos
Gram (-) son más susceptibles a la desecación que los cocos
Gram (+). Las endoesporas bacterianas son muy resistentes a la desecación
pudiendo permanecer viables indefinidamente.
1.- Oxido de etileno: El requerimiento esencial para un agente
químico esterilizante es que sea volátil así como tóxico
para los microorganismos, de manera que pueda ser fácilmente eliminado
del objeto esterilizado después del tratamiento. Normalmente se utiliza
el óxido de etileno, un líquido que hierve a 10,7° C.
Se usa en la industria para la esterilización de placas Petri, jeringas
y otros objetos de plástico que se funden a temperaturas superiores
a los 100° C. Debido a su alto poder de penetración estos objetos
se empaquetan primero y después se esterilizan. El óxido de
etileno actúa inactivando enzimas y otras proteínas que contienen
grupos sulfidrilos (R-SH) mediante una reacción llamada alquilación
(R-S-CH2CH2O-H).
2.- Glutaraldehido: Una solución acuosa al 2% presenta una
amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, células
vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar
instrumentos urológicos y ópticos.
Esterilización: es el proceso de destrucción de
todas las formas de vida microbiana.
Desinfección: es el proceso de destrucción de los agentes
infecciosos.
Desinfectantes: son aquellas sustancias químicas que matan
las formas vegetativas y no necesariamente las formas de resistencia de
los microorganismos patógenos. Se refiere a sustancias empleadas
sobre objetos inanimados.
Antisépticos: son aquellas sustancias químicas que
previenen el crecimiento o acción de los microorganismos ya sea destruyéndolos
o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se refiere a sustancias que se
aplican sobre el cuerpo.
1.- Metales: Los más efectivos son el mercurio, plata ,cobre
y zinc. Actúan inactivando las proteínas celulares al combinarse
con ellas. Entre los compuestos de mercurio que se emplean como antisépticos
en heridas superficiales de la piel y mucosas están el mercurocromo
(mercromina) y el mertiolato. Entre los compuestos de plata utilizados
como antisépticos está el nitrato de plata (AgNO3) que en
solución al 1% se ha utilizado para prevenir infecciones gonocócicas
en los ojos de los recién nacidos aunque actualmente se está
reemplazando por antibióticos como la penicilina. Entre los compuestos
de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO4) que se utiliza
como algicida en los recipientes abiertos que contienen agua. También
es fungicida por lo que se utiliza para controlar las infecciones fúngicas
de plantas (Mezcla Bordolesa). Los compuestos de zinc también
son fungicidas por lo que se utilizan para tratar el pié de atleta.
2.- Acidos y álcalis: Actúan alterando la permeabilidad
y coagulando las proteínas. En general los ácidos son más
eficaces que los álcalis. Dentro de estos compuestos se encuentran
el sulfúrico (H2SO4), nítrico (HNO3), hidróxido
sódico (NaOH) e hidróxido potásico (KOH).
Tienen aplicación limitada debido a su naturaleza cáustica
y corrosiva. Aún así el NaOH se utiliza en la industria del
vino para limpiar las cubas de madera.
3.- Compuestos inorgánicos oxidantes: actúan oxidando
los componentes de la membrana y enzimas. El agua oxigenada (H2O2)
al 6% (20 volúmenes) se utiliza como antiséptico en pequeñas
heridas de la piel.
4.- Halógenos: Los halógenos especialmente el cloro
y el iodo son componentes de muchos antimicrobianos. Los halógenos
son agentes fuertemente oxidantes por lo que son altamente reactivos y destructivos
para los componentes vitales de las células microbianas.
Cloro: La muerte de los microorganismos por acción del cloro
se debe en parte a la combinación directa del cloro con las proteínas
de las membranas celulares y los enzimas. Así mismo en presencia
de agua desprende oxígeno naciente (O) que oxida la materia orgánica:
El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfección del agua
de bebida y piscinas. El hipoclorito sódico (lejía) al 1%
se puede utilizar como desinfectante doméstico.
Iodo: El mecanismo mediante el cual el iodo ejerce su acción
antimicrobiana es debido a su acción oxidante. Además la habilidad
que tiene el iodo para combinarse con el aminoácido tirosina resulta
en la inactivación de enzimas y otras proteínas. El iodo se
puede utilizar como antiséptico bajo dos formas: i) tintura de
iodo, es una solución alcohólica (tintura) de iodo (I2)
más ioduro potásico (KI) o ioduro sódico (NaI). ii)
iodóforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actúan
como agentes transportadores y solubilizadores del iodo. Por ejemplo, la
povidona iodada (Betadine) es un complejo de iodo y polivinil pirrolidona
(PVP). Los iodóforos tienen la ventaja de que no tiñen la
piel. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente para desinfectar
la piel así como en la desinfección de pequeñas cantidades
de agua. Los vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire.
1.- Alcoholes: El alcohol metílico (1C) es menos bactericida
que el etílico (2C) y además es altamente tóxico. Hay
un aumento en el poder bactericida a medida que aumenta la longitud de la
cadena carbonada; pero como los alcoholes con peso molecular superior al
del propílico (3C) no se mezclan en todas las proporciones con el
agua, no se suelen utilizar como desinfectantes. Los alcoholes actúan
desnaturalizando las proteínas, disolviendo las capas lipídicas
y como agentes deshidratantes. El etanol al 96% se usa como antiséptico
de la piel y como desinfectante en los termómetros clínicos
orales y algunos instrumentos quirúrgicos.
2.- Fenol y compuestos fenólicos: Una solución acuosa
al 5% de fenol mata rápidamente a las células vegetativas
de los microorganismos. Sin embargo, las esporas son mucho más resistentes
al fenol. Debido a que el fenol es tóxico y tiene un olor desagradable
ya casi no se usa como desinfectante o antiséptico, siendo reemplazado
por compuestos fenólicos que son sustancias derivadas del
fenol menos tóxicas y más activas frente a los microorganismos.
Lysol es una mezcla de compuestos fenólicos que se utiliza para desinfectar
objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El fenol y compuestos
fenólicos actúan alterando la permeabilidad de la membrana
citoplásmica así como desnaturalizando proteínas.
1.- Técnica de dilución en tubo: Primero se realizan
diferentes diluciones del agente químico. El mismo volumen de cada
dilución se dispensa en tubos estériles. A cada tubo se le
añade la misma cantidad de una suspensión del microorganismo
utilizado como prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere
una alícuota de cada tubo a otro tubo que contenga medio de cultivo.
Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura óptima de crecimiento
del microorganismo utilizado como prueba durante 24 a 48 horas. Al cabo
de este tiempo se examina el crecimiento del microorganismo mediante la
aparición de turbidez en el tubo (crecimiento +) o ausencia de turbidez
(crecimiento -). Aquellos tubos que presenten crecimiento negativo indican
la dilución a la cual ese agente químico mata al microorganismo
utilizado como prueba cuando este microorganismo es expuesto al agente químico
durante ese período de tiempo.
2.- Técnica de la placa de agar: Se inocula una placa que
contenga medio de cultivo sólido con el microorganismo utilizado
como prueba. El agente químico se coloca en el centro de la placa,
bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al cabo de
24 a 48 horas se observan zonas de inhibición (crecimiento -) alrededor
del agente químico. Una modificación de esta técnica
es la incorporación del agente químico en el medio de cultivo
antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula con el
microorganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento
microbiano.
3.- Técnica del coeficiente fenólico: Es una técnica
estandarizada que se utiliza para comparar el poder desinfectante de un
agente químico frente al del fenol. Es una modificación de
la técnica de dilución en tubo tal como se describe a continuación:
(i) Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes
diluciones del desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda
serie de tubos que contengan diferentes diluciones de fenol. (iii)
Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas
del microorganismo utilizado como prueba (cepas específicas de Salmonella
typhi o Staphylococcus aureus). (iv) A los 5, 10 y 15
minutos se recoge una alícuota de cada tubo que se inocula en otro
tubo que contenga medio de cultivo estéril. (v) Estos tubos
inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento
del microorganismo (aparición de turbidez). (vi) La mayor
dilución del desinfectante que mate a los microorganismos en 10 minutos
pero no los mate en 5 minutos se divide por la dilución mayor de
fenol que dé los mismos resultados. El número obtenido es
el coeficiente fenólico de ese desinfectante.