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2º TEXTO


b) Técnica de membrana-filtrante

El número de organismos coliformes presentes en el agua puede también determinarse mediante la filtración de volúmenes específicos de la muestra a través de filtros de membrana. Por lo general, están compuestos de ésteres de celulosa, típicamente con poros de 0,45 mm de diámetro que retienen bacterias coliformes y de muchas otras clases presentes en la muestra. Después se incuban membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. En la membrana se desarrollarán colonias características que producen ácido o aldehído, y son las que se contarán ya sea como organismos coliformes presuntivos o bacterias coliformes fecales, según haya sido la temperatura de incubación. Puesto que la producción de gas no se puede detectar en las membranas, se asumirá que todas las colonias que producen ácido o aldehído también producen gas. Sin embargo, la formación de gas podrá demostrarse más adelante a través de las técnicas de confirmación que se apliquen subsecuentemente. Los resultados se expresarán en términos del número de organismos por 100 ml de la muestra original.

En la práctica, la técnica de membrana filtrante ofrece resultados comparables a los que se obtienen con el método de tubos múltiples. No obstante, si se filtra la muestra a través de dos membranas, y una se incuba a 35 ó 37°C y la otra a 44 ó 44,5°C, el procedimiento de confirmación se simplificará en cierto modo, ya que es posible hacer un cálculo directo del número de bacterias coliformes fecales presentes a la temperatura más elevada.

Una de las ventajas del método de membrana-filtrante es la prontitud con que pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo rápidamente acciones correctivas y operar de nuevo en forma normal. Esta técnica puede aplicarse en el análisis de casi todos los tipos de agua, excepto en la que muestra elevada turbiedad, pues la membrana se obstruirá antes de que pueda filtrarse la cantidad suficiente. Tampoco es conveniente el empleo de las membranas cuando se trata de agua que contiene pocos organismos coliformes y muchos otros organismos que pueden desarrollarse en los medios de cultivo empleados, y estos últimos organismos tenderán a cubrir la membrana, interfiriendo con el crecimiento de los del grupo coliforme. Si en el agua predominan organismos que no producen gas, pero si fermentan la lactosa, como es el caso de las Aeromonas , deben confirmarse todas las colonias de coliformes presuntivos desarrolladas en las membranas debido a la alta proporción de resultados falso-positivos. La prueba de la oxidasa ayudará a eliminar rápidamente dichos resultados falso-positivos. Los organismos aeróbicos portadores de esporas, que pueden producir reacciones presuntivas falsas en los medios liquidos de cultivo, no ejercerán la misma acción en las membranas. La técnica de la membrana se puede modificar para inducir a la recuperación de organismos atenuados. La incubación previa a temperaturas inferiores, o el uso de medios de cultivo menos selectivos, pueden ayudar a que los organismos extenuados se recuperen e inicien su desarrollo, completándose después la prueba en la forma acostumbrada.

En la técnica de membrana filtrante se efectúa un recuento directo de las colonias individuales, pero todavía estará sujeto a errores de tipo estadístico. Además del recuento, se puede también analizar la morfología de las colonias y efectuar subculturas directas, reduciéndose, así, la posibilidad de que se produzcan reacciones falsas y positivas a partir de cultivos mezclados. Si bien solo es necesario un equipo limitado, suele ser inicialmente más costoso que el equipo empleado para la prueba de tubos múltiples. Los filtros de membrana pueden volver a utilizarse, siempre que no hayan sufrido daños después de que han sido debidamente lavados y esterilizados mediante ebullición, y toda vez que se utilicen únicamente con el mismo medio de cultivo. Por otra parte, es preciso señalar que diferentes membranas tienen diferentes características; por eso es importante asegurarse de que sean adecuadas no sólo para el desarrollo de los organismos que se quiere detectar, sino también para las particularidades del agua que está analizándose.

Los resultados que se obtienen con la filtración por membrana no coincidirán necesariamente con los obtenidos a través del método de tubos múltiples, aunque en la práctica ambos ofrecerán resultados comparables. En ese sentido, es muy importante que se lleven a cabo series adecuadas de pruebas paralelas, utilizando ambos métodos, a fin de precisar si la técnica de filtración con membrana es adecuada para el tipo de agua que se va a analizar.

Aparatos y técnicas de filtración. El aparato de filtración consiste de un disco incrustado sostenido por empaquetaduras de jebe de silicón y que se ajusta a una base donde puede fijarse un embudo graduado. El disco incrustado o perforado sostiene el filtro de membrana. Al momento de usarlo, el montaje que sujeta el filtro se coloca encima de un frasco que tiene un brazo lateral conectado a un sistema de vacío. Se puede montar una serie de estos conjuntos en forma múltiple, conectados a un mismo extractor, permitiendo de ese modo que se filtren varias muestras a un mismo tiempo. Después que se ha filtrado el agua, se retira la membrana y se coloca vuelta hacia arriba, ya sea en un medio de agar apropiado o sobre una almohadilla empapada en un medio de cultivo líquido en una placa Petri, para incubación a una temperatura adecuada. En otro acápite se proporcionan detalles más completos sobre el equipo necesario.

Después de la incubación, deberán examinarse las membranas bajo una buena iluminación. La apariencia de las colonias dependerá del medio de cultivo empleado, pero todas las colonias características deberán contarse sin tener en cuenta su tamaño. Si fuera necesario, se pueden subcultivar colonias individuales en un medio líquido con fines de confirmación, o haciéndolo en un medio sólido para asegurar la pureza antes de pasar a efectuar mayores pruebas de diferenciación.

Cuando se analizan muestras de agua para determinar la presencia de organismos coliformes (coliforme total) y bacterias coliformes fecales (E. coli presuntiva), se necesitará contar con dos membranas separadas y con los medios de cultivo adecuados, y serán necesarios diferentes grados de temperatura para la incubación.

Volumen del agua a ser analizada. Se deberán efectuar recuentos del número total de organismos coliformes y de bacterias coliformes fecales, empleando para ello volúmenes separados de agua, normalmente de 100 ml. Salvo en los casos en que exista la probabilidad de que las muestras contengan más de 100 organismos coliformes en 100 ml, será necesaria la filtración de 100 ml para cada prueba. Cuando se trata de muestras contaminadas, se deben escoger los volúmenes de tal manera que el número de colonias en las membranas esté comprendido, aproximadamente, entre 10 y 100. Si este volumen es menor a 10 ml, se mezclará con un diluyente estéril -como puede ser una solución de Ringer de un cuarto de concentración, 1 g/litro de agua de peptona, o agua de dilución amortiguada- de manera que se filtre un mínimo de 10 ml a través de la membrana.

Elección del medio de cultivo. Pueden utilizarse diversos medios de cultivos para realizar exámenes de organismos coliformes mediante el método de membrana-filtrante. Entre ellos, pueden usarse los siguientes para recuento de organismos coliformes a 35-37°C, y de bacterias coliformes fecales a 44°C: agar de lactosa tergitol, agar de lactosa tergitol TTC( cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio) y caldo de lactosa y sulfato de lauril. Los medios de cultivo endotípicos sólo deben usarse para recuentos de coliformes a una temperatura de 35 ó 37°C, y el caldo MCF (medio para bacterias coliformes fecales) debe emplearse a una temperatura de 44°C para el recuento de coliformes fecales. Si bien todos estos medios se basan en la fermentación de lactosa para detectar los organismos coliformes presuntivos, la reacción característica varía según el medio empleado. El brillo metálico característico de las colonias en un medio de cultivo Endo depende de la formación de aldehído.

Pruebas confirmativas. La decisión respecto a qué colonias deben confirmarse dependerá tanto del agua sometida a análisis como de las razones para efectuar el mismo. La
información que se requiere es similar a la utilizada en las reacciones presuntivas positivas del método de tubos múltiples. Para confirmar la presencia de organismos coliformes, debe comprobarse la producción de gas a partir de la lactosa dentro de un lapso de 48 horas, a una temperatura de 35 ó 37°C; en el caso de bacterias coliformes fecales, en un lapso de 24 horas y a una temperatura de 44 ó 44,5°C. Además, si se produce indol a partir del triptófano a una temperatura de 44°C se estará confirmando la presencia del E. coli presuntivo. Los procedimientos de confirmación difieren ligeramente de los que se emplean en las pruebas con tubos múltiples, debido a que las colonias provenientes de las membranas algunas veces se desarrollan mal en medios selectivos, como el caldo CBV, que es preferible no utilizarlo para la confirmación directa. Igualmente, debido a que las membranas casi siempre pueden incubarse tanto a 33 y 44°C ó a 37 y 44,5°C, es posible confirmar la existencia de colonias en forma directa si se comprueba la producción de gas a 44°C, sin efectuar la prueba a una temperatura más baja. Se puede comprobar la producción de gas a 35 ó 37°C con agua de lactosa de peptona o caldo de triptosa y lauril , y a 44°C con agua de lactosa de peptona o caldo de EC. Será preciso usar agua de triptona para la producción de indol.

Lo ideal sería que se analizaran todas las colonias presuntivas presentes en las membranas, aunque no siempre puede realizarse. Sin embargo, debido a que los organismos coliformes no deberían estar presentes en aguas tratadas, todas las colonias provenientes de este tipo de muestras se investigarán más extensamente. En el caso de agua natural antes de ser tratada, deberán diluirse las muestras con objeto de obtener un número de colonias retenidas en las membranas que puedan manipularse. En estas circunstancias, se recomienda analizar algunas colonias que resulten sospechosas, de preferencia un mínimo de 10, a fin de determinar la naturaleza y alcance de la contaminación.

1.6.2.3 Diferenciación de los organismos coliformes

Debido a la importancia que tiene el confirmar la identidad de todos los E. coli presuntivos en el agua potable, es importante llevar adelante otras pruebas de diferenciación, recurriendo, si fuera el caso, al uso de equipos portátiles para identificación que se obtienen comercialmente. En los climas templados, cabe esperar que con estas pruebas quede confirmado que los organismos que producen ácido, aldehído, gas o indol a una temperatura de 44°C, son efectivamente E. coli . Cuando se trata de climas cálidos, otros organismos coliformes -como las especies de Enterobacter spp., de menor significación sanitaria- pueden mostrar una reacción E. coli presuntiva, pero pueden ser diferenciados mediante estas pruebas. Las pruebas de diferenciación deben practicarse con cultivos puros que hayan sido aislados de los medios de cultivo de confirmación mediante técnicas de subcultivo en placas que contengan un medio no selectivo. Se usarán luego las colonias típicas para las pruebas de indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer, citrato y oxidasa y, si fuera necesario, se buscarán también otras reacciones bioquímicas. Los resultados obtenidos, junto con los que se obtengan a partir de los medios de confirmación, se usarán para identificar los E. coli , según lo especificado en la sección 1.6.2.1. Las mismas pruebas pueden también emplearse para hacer la diferenciación de otros organismos coliformes.

1.6.3 Detección de estreptococos fecales

Para la detección presuntiva de este grupo de organismos, puede recurrirse tanto al método de tubos múltiples como al de filtración con membrana, estando el empleo de ambas técnicas sujeto a las mismas limitaciones que se anotaron anteriormente para el caso de los organismos coliformes. Es posible que los resultados de estas pruebas necesiten ser confirmados.

1.6.3.1 Definición de los estreptococos fecales

Los estreptococos fecales pertenecen a los grupos serológicos de Lancefield D y Q, que incluyen los S. faecalis y sus variedades, S. faecium, S. durans, S. bovis , y cepas cuyas propiedades las sitúan en un ámbito intermedio entre las variedades anteriores. También están comprendidos los S. equinus y S. avium . Tienen capacidad de desarrollarse a temperaturas de 45°C en presencia de 40% de bilis y en concentraciones de azida de sodio que son inhibitorias de organismos coliformes y de la mayoría de otras bacterias gramnegativas. La reacción de catalasa es negativa. Algunas especies resisten el calor a 60°C durante 30 minutos, y se desarrollarán a un pH de 9,6 y en medios de cultivo que contengan 65 g de cloruro de sodio por litro.

1.6.3.2 El método de tubos múltiples

Se agregan determinados volúmenes de agua a tubos conteniendo caldo de glucosa (dextrosa)-azida de concentración simple o doble y se incuban a 35 ó 37° ± 0,5°C durante 48 ± 3 horas, prolongándose la incubación por 72 horas, si fuese necesario. Los tubos que indiquen producción de ácido y turbiedad, y con frecuencia también sedimentos, se considerarán que contienen estreptococos fecales presuntivos. No se investiga la producción de gas.

La presencia de estreptococos fecales en los tubos que indican reacciones positivas deberá confirmarse mediante la inoculación de caldo etílico de violeta azida e incubarse a una temperatura de 35 ± 0,5°C durante 48 ± 2 horas.

Normalmente, se requiere una inoculación considerable de los medios confirmatorios. Los tubos que indiquen una reacción positiva confirmada para estreptococos fecales exhibirán un sedimento azul violáceo y presencia de turbiedad. Otra opción para un procedimiento de confirmación, consiste en efectuar subculturas de los tubos presuntivos en placas de agar de enterococo selectivo Pfizer (ESP). El crecimiento de colonias de tonalidad marrón oscura, con aureolas de color marrón, en las 24 horas siguientes y a una temperatura de 35 ± 0,5°C, servirá para confirmar la presencia de estreptococos fecales.

El número de estreptococos fecales presuntivos y confirmados en 100 ml de la muestra original, ha de calcularse de acuerdo a lo descrito para el caso de organismos coliformes, usando las tablas de probabilidad.

1.6.3.3 Técnica de membrana-fltrante

Dos medios de cultivo, el agar KF y el agar m-Enterococo (Slanetz y Bartley), ambos conteniendo azida, pero con distinto contenido de carbohidratos, son los que generalmente se emplean para la enumeración de estreptococos fecales mediante la técnica de membrana-filtrante. Cuando se usa el agar m-Enterococo, la selectividad está ligada a la temperatura de incubación; si se incuba a 37 ± O,5°C durante 4 horas, seguido de un lapso de 44 ± 3 horas a 44 ± 0,25°C, el método es especialmente selectivo para individualizar las S. faecalis y S. faecium . Esta puede ser una ventaja operativa, ya que puede servir de complemento a la prueba de coliformes para confirmar la presencia de contaminación fecal, especialmente de origen humano. La recuperación íntegra de estreptococos fecales en este medio de cultivo es a veces deficiente. Para la detección de todos los estreptococos fecales en el agua, el medio de cultivo KF es el que generalmente más se usa, dado su buen índice de recuperación y selectividad. La capacidad selectiva del agar KF puede aumentarse si el medio se esteriliza mediante ebullición en vez de en el autoclave. Las membranas se incuban en agar KF a una temperatura de 35 ó 37° ± 0,5°C durante 48 ± 3 horas. Puesto que este medio de cultivo es tanto estable como selectivo para los estreptococos fecales, las membranas pueden transportarse en el mismo hasta por 3 días antes de que la prueba se haya completado en el laboratorio. Los medios de cultivo que se emplean en el método de membrana-filtrante para estreptococos fecales suelen ser muy selectivos, por lo que se da por supuesto que las colonias de color rojo que se forman tanto en el agar KF como en el agar m-Enterococo son estreptococos fecales sin tener que recurrir a una confirmación más profunda. Si se considera necesario, las pruebas confirmativas deberán demostrar el crecimiento de bacterias en presencia de 40% de bilis, a una temperatura de 44°C, y con una reacción negativa de catalasa.

La densidad de los estreptococos fecales deberá expresarse en números de colonias por 100 ml de la muestra original.

1.6.3.4 Diferenciación de los estreptococos fecales

Cuando se utiliza la prueba para estreptococos fecales con objeto de evaluar la fuente de contaminación, puede que sea necesario identificar las especies presentes. Después del análisis inicial, todos los cuerpos que hayan sido aislados y que sean catalasa-negativos podrán ser mejor identificados mediante pruebas que permitan su desarrollo a 45°C, a un pH de 9,6 y en 65 g/litro de cloruro de sodio, por la hidrólisis de esculina y almidón, al igual que por la fermentación de lactosa y reducción de 1 g/litro de leche de azul de metileno.

1.6.4 Detección de clostridios reductores de sulfito

Los clostridios que reducen sulfito, especialmente los C. perfringens (C. welchii ), también pueden utilizarse como indicadores de contaminación fecal. Los organismos de este grupo se caracterizan por su habilidad para formar esporas y para reducir el sulfito a sulfuro. Esta característica se utiliza en los medios de cultivo para la detección presuntiva de clostridios mediante la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro. Para la detección de esporas, se inactivan todas las células vegetativas calentando las muestras de agua a una temperatura de 75-80°C durante 10 minutos.

1.6.4.1 Definición de los clostridios reductores de sulfito

Este grupo de organismos está compuesto por bacterias anaeróbicas que reducen el sulfito, forman esporas, son grampositivas, son catalasa-negativas y tienen forma abastonada. Además, los C. perfringens fermentan la lactosa, la sucrosa y el inositol con producción de gas, producen una típica reacción de "coágulo turbulento" en leche de tornasol, hidrolizan la gelatina, y producen también lecitinasa y fosfatasa ácida. Se trata de un microorganismo inamovible (no motor).

Tanto el método de tubos múltiples como el de filtración con membrana pueden usarse para la detección de clostridios reductores de sulfito.

1.6.4.2 El método de tubos múltiples

El procedimiento es similar al descrito para los organismos coliformes, excepto que no se busca producción de gas. A fin de preservar condiciones anaeróbicas durante todo el período de incubación, se utilizarán botellas con tapas de rosca, que se llenarán con caldo que contenga glucosa y sulfito, como puede ser el medio diferencial reforzado para clostridios (MDRC). Se inocularán volúmenes adecuados de la muestra en frascos que contengan medios de cultivo con concentración simple y doble y se incubarán a temperaturas de 35 ó 37 ± 0,5°C durante 48 ± 3 horas. Se dará por supuesto que los tubos que muestren algún tipo de oscurecimiento contienen bacterias reductoras de sulfito y, si la muestra se calentó antes de la prueba, se asumirá que los tubos contienen clostridios que forman esporas y reducen sulfitos.

La presencia de C. perfringens podrá confirmarse mediante las subculturas producidas en los frascos con reacciones positivas presuntivas, en tubos con leche de tornasol, por incubación a 35 ó 37 ± 0,5°C durante 48 ± 3 horas. La reacción típica de "coágulo turbulento" y de acidez, confirmará la presencia de C. perfringens . Si es necesaria una confirmación más precisa, pueden efectuarse pruebas para determinar la motilidad y la reducción de nitrato.

1.6.4.3 Técnica de membrana-filtrante

No existe un solo medio de cultivo que haya tenido aceptación general para la enumeración de clostridios reductores de sulfito en el agua; se ha recomendado, sin embargo, el uso de agar de sulfito de hierro (ASH), de agar de sulfitopolimixina- sulfadiazina (SPS) y del medio de cultivo para Clostridium perfringens (mCP). El tiempo de incubación para cada medio de cultivo es de 24 horas. Las temperaturas de incubación varían según el medio empleado, siendo de 37°C para SPS, 45°C para mCP y 48°C para ASH. Se necesitan condiciones anaeróbicas para facilitar el crecimiento, y las mismas pueden obtenerse con el uso de capas superimpuestas de agar con ASH y SPS, pero no con mCP, debido a la necesidad de tener que exponer a continuación las placas al vapor de amoníaco, para comprobar la reducción de fosfatasa, impide la aplicación de esta técnica. En consecuencia, la incubación de mCP deberá hacerse en una atmósfera anaeróbica.

Si las muestras se calientan a una temperatura de 75-80°C antes de la filtración, estas técnicas serán altamente selectivas para individualizar los clostridios reductores de sulfito. Será necesario confirmar la presencia de C. perfringens si solo se utiliza agar de sulfito de hierro, ya que los otros medios, SPC y mCP, que contienen los antibióticos adecuados, son muy selectivos respecto a este organismo. No obstante, los medios de cultivo que contienen sulfito han resistido la prueba del tiempo, por lo que se recomienda su uso como medios de cultivo estándar; además, poseen la ventaja de hacer que la técnica de membrana-filtrante sea similar, en cuanto a uso y modo de operar, al método de NMP.

1.6.5 Pseudomonas aeruginosa*

Es posible definir y distinguir fácilmente las P. aeruginosa de otras especies fluorescentes de Pseudomonas mediante las características siguientes que las diferencian: producción de pigmento, crecimiento a 42°C, hidrólisis de la caseína y uso de fuentes poco comunes de carbón orgánico.

1.6.5.1 Definición de P. aeruginosa

La P. aeruginosa es una bacteria gramnegativa, no esporulada, de forma abastonada, que crece a una temperatura de 42°C, puede producir piocianina y pigmentos fluorescentes, es positiva a la oxidasa y la catalasa, reduce el nitrato más allá de nitrito, licúa la gelatina, hidroliza la caseína, pero no el almidón, oxida la glucosa y reduce la acetamida a amoníaco.

1.6.5.2 Método de tubos múltiples

Los medios de cultivo que contienen asparagina fomentan y vigorizan la formación de pigmento, y esto constituye la base de la modificación del caldo de Drake que normalmente se usa en el método de tubos múltiples. Si se agrega etanol (20 ml/l) al medio de cultivo, se evitará el crecimiento de otras bacterias gramnegativas durante el período de incubación a una temperatura de 35 ó 37°C. Se añadirán volúmenes de muestras adecuados a tubos que contengan caldo simple y de concentración doble para incubación a una temperatura de 35 ó 37°C durante 4 días. Todos los tubos que indiquen algún tipo de crecimiento se examinarán diariamente a fin de verificar la producción de pigmento y la fluorescencia bajo la luz ultravioleta. La presencia de P. aeruginosa en estas reacciones presuntivas deberá confirmarse mediante subcultivos en agar de leche de cetrimida o en caldo de acetamida. La hidrólisis de la caseína, junto con la producción de un pigmento fluorescente verdiazul después de la incubación de agar de leche a 41,5°C durante 24 ± 2 horas, y la producción de condiciones alcalinas, que indicará la presencia de una coloración púrpura, en las 36 horas siguientes a 35 ó 37°C con caldo de acetamida, confirmarán la presencia de P. aeruginosa.

1.6.5.3 Técnica de membrana-filtrante

Por lo general, se usará un medio de cultivo A de King, modificado mediante la adición de etanol. Después de la filtración, se colocan las membranas sobre un medio modificado A de King y se incuban durante 48 ± 3 horas a 35 ó 37°C. Las colonias fluorescentes y con pigmentación verde se considerarán como P. aeruginosa. Las colonias se confirmarán en agar de leche a 41,5°C para comprobar la hidrólisis de caseína y también la producción de pigmento verde y fluorescencia en las 24 horas siguientes.

1.6.6 Recuento de organismos aerobios

Los procedimientos comunes que suelen utilizarse para calcular el contenido de bacterias en el agua es el método de vaciado en placas y untado en la superficie. Recientemente también se ha desarrollado una técnica para filtrar con membrana.

Para el recuento de colonias, los medios nutrientes que se empleen favorecerán el crecimiento de solo una proporción de los microorganismos presentes en cualquier muestra de agua, y esto variará según el medio empleado. Por lo general, los organismos anaeróbicos no crecerán ni siquiera en placas de vaciado. Por otra parte, como los microorganismos también crecen en aglutinaciones y cadenas, al efectuar el recuento de los que verdaderamente formaron colonias, se estará subestimando en gran manera el número verdadero de microorganismos viables presentes en la muestra. Como microorganismos diferentes crecerán dependiendo de las diferentes temperaturas óptimas es un procedimiento normal incubar dos placas preparadas con la misma muestra a una temperatura de 35-37°C durante 1-2 días, y otras dos a una temperatura de 20-22°C durante 3 días. El período de incubación influye en el recuento de colonias, por lo que será muy importante emplear estrictamente la misma práctica, con objeto de que los resultados siempre sean comparables. En los casos de agua embotellada, se suele incubar las placas a temperaturas de 35 ó 37°C durante 3 días. La cuenta bacteriana se expresará como número de unidades que forman colonias en 1 ml de la muestra original, especificándose el medio de cultivo, la temperatura y período de incubación, y el método utilizados. En resumen, la técnica puede delinearse de la manera siguiente: se efectúa una serie de diluciones de la muestra, a múltiplos de 10, dependiendo de la naturaleza y antecedentes del agua. A partir de cada dilución, se agregará
1 ml a cada una de dos placas Petri esterilizadas; luego se añadirá, derretido, agar nutriente a 44-46°C (15 ml) a cada placa, mezclándose la muestra y el medio de cultivo mediante rotación. Después que el agar se ha solidificado, se invierten las placas y se incuban a la temperatura deseada. Se cuentan seguidamente las colonias presentes en cada pareja de placas, y se obtiene el número de microorganismos en la muestra original multiplicando la media aritmética de los recuentos por la recíproca de la dilución. Cuando no haya placas con recuentos que fluctúen entre las 30 y las 300 colonias, éstas deberán ser siempre contadas, pero el resultado se anotará como tan solo un estimado.

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