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3º TEXTO |
PRODUCCION DE INDOL POR ANAEROBIOS
La prueba de producción de indol para anaerobios se puede realizar por el
sistema clásico de la prueba en tubo o mediante la reacción de la «mancha
de indol».
Prueba en tubo
Se utiliza el medio descrito para microorganismos aerobios o el medio indol-nitrito,
usando entonces como reactivo para poner en evidencia la producción de indol,
el de Ehrlich.
La inoculación se realiza de la misma forma que para las bacterias aerobias,
incubando los tubos a 35-37° C, en anaerobiosis durante veinticuatro-cuarenta
y ocho horas. A continuación se pasan a un tubo de ensayo 2 ml de caldo de
cultivo que presente un buen crecimiento y se añade sobre el mismo 1 ml de
xileno. Mezclar y dejar en reposo por lo menos dos minutos. Agregar por las paredes
del tubo 0,5 ml de reactivo de Ehrlich.
Se considera como prueba positiva la aparición de un anillo de color rosa
en unos diez a quince minutos. En caso negativo se formará un anillo de color
amarillo.
Prueba de la mancha de indol
Se realiza a partir de un cultivo en agar sangre, preparado con un medio base que
contenga triptófano.
Tomar con un asa una o más colonias y extenderlas sobre papel de filtro humedecido
previamente con una solución preparada de la siguiente forma: 1g de p- dimetilaminocinnamaldehído
en 100 ml de ácido clorhídrico diluido (10ml de ácido clorhídrico
concentrado y 90 ml de agua destilada).
Se considera como prueba positiva la aparición inmediata de coloración
azul o azul verdosa alrededor de la extensión.
Si no hay cambio de color, cualquier otro color o la aparición tardía
del mismo, se interpretarán como prueba negativa.
FENOMENO DE KANAGAWA
Se conoce como fenómeno de Kanagawa la capacidad de la especie Vibrio parahaemolyticus
de producir hemólisis en hematíes de sangre humana o de conejo.
Medio de cultivo
Se utiliza agar de Wagatsuma.
Inoculación
Inocular la superficie del agar en manchitas.
Incubación
Incubar a 35-37° C durante veinticuatro horas.
Interpretación de los resultados
La prueba se considera positiva si aparece betahemólisis en el medio (Kanagawa
positivo).
PRUEBA DE LA LECITINASA
La prueba de la lecitinasa pone de manifiesto la producción de dicha enzima
por determinados microorganismos, capaces de actuar sobre la lecitina, sustancia
orgánica nitrogenada y fosfatada, contenida principalmente en la yema de huevo.
Medio de cultivo
Se utiliza el agar yema de huevo.
Fórmula en g/l de agua destilada:
– Tripticasa: 40 g.
– Fosfato disódico: 5 g.
– Cloruro sódico: 2 g.
– Sulfato de magnesio al 5 por 100: 0,2 ml.
– Glucosa: 2 g.
– Agar: 25 g.
– pH: 7,3-7,4.
Una vez preparado y autoclavado el medio, enfriar a 55-60° C. Añadir en
condiciones asépticas una emulsión estéril de yema de huevo,
mezclando hasta obtener una suspensión homogénea y repartir en placas.
Inoculación
A partir de un cultivo joven, efectuar una siembra en aislamiento.
Incubación
Incubar a 35-37° C, en anaerobiosis, durante cuarenta y ocho horas.
Interpretación de los resultados
Las colonias productoras de lecitinasa, forman una zona opaca a su alrededor, que
se aprecia mejor con iluminación oblicua.
En la práctica la visualización de la zona opaca no suele ser fácil,
por lo que se recomienda realizar la prueba de Nagler.
PRUEBA DE LA LECHE CON TORNASOL
Se basa en la capacidad de ciertos microorganismos de producir determinadas reacciones
metabólicas en medios con leche. Estas reacciones se ponen de manifiesto mediante
un indicador redox y de pH, como el tornasol.
Medio de cultivo
Se utiliza el medio de la leche tornasolada pH = 6,8, que permite determinar: fermentación
de la lactosa, caseolisis (peptonización), y coagulación de la caseína.
Fórmula en g/l de agua destilada:
– Leche descremada deshidratada: 100 g.
– Polvo tornasol: 0,75 g.
Mezclar los componentes calentando suavemente hasta disolución. Añadir
pequeñas cantidades de tornasol hasta lograr un pH de 6,8. Distribuir en tubos
y esterilizar en autoclave.
Durante el autoclavado la leche tornasolada se reduce a una base de color blanco,
que al enfriarse absorbe oxígeno y vuelve al color púrpura inicial.
Inoculación
Inocular los tubos a partir de un cultivo joven.
Incubación
Incubar a 35-37° C en aerobiosis o anaerobiosis, según el microorganismo
estudiado, durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas. Pueden ser necesarios períodos
de incubación más largos.
Interpretación de los resultados
– Color rosado en el medio de cultivo: Fermentación de la lactosa. La reacción
es ácida.
– No hay cambio de color en el medio de cultivo: No se ha producido fermentación
de la lactosa ni utilización de sustancias nitrogenadas del medio.
– Color azul en el medio de cultivo: No hay fermentación de la lactosa, pero
el microorganismo ha utilizado las sustancias nitrogenadas del medio, produciendo
reacción alcalina.
– Color blanco en el medio de cultivo: El color blanco indica que se ha producido
una peptonización de la proteína de la leche (digestión). El
tornasol se reduce a una leucobase.
– Producción de coágulo: Su presencia indica coagulación de
la leche.
– Producción de gas: La aparición de burbujas en el medio indica la
producción de gas (C02 y H2).
PRUEBA DE LA LIPASA
Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias de descomponer las grasas en
ácidos grasos y glicerol, por acción de la enzima lipasa.
Medio de cultivo
Se utiliza el agar yema de huevo, cuya composición se detalla en la prueba
de la lecitinasa.
Inoculación
Sembrar una colonia aislada en agar yema de huevo. Conviene utilizar placas guardadas
en jarras de anaerobiosis, por lo menos cuatro horas antes de su uso.
Incubación
Incubar a 35-37° C en anaerobiosis, durante cuarenta y ocho horas.
Interpretación de los resultados
Una reacción lipasa positiva está indicada por un brillo oleoso, iridiscente
o nacarado sobre la superficie del crecimiento. Se debe observar la placa con iluminación
indirecta (luz oblicua).
La reacción puede ser retardada, por lo que se deben conservar las placas
durante una semana, antes de darlas como negativas.
Con frecuencia el aspecto del halo formado alrededor de las colonias, puede confundirse
con la producción de lecitinasa. Para diferenciar ambas pruebas se utiliza
un revelado que consiste en añadir sobre la placa, una solución saturada
de sulfato de cobre. Se deja reposar veinte minutos y se elimina el exceso. A continuación
se incuban las placas a 35-37° C. durante unos minutos. La presencia de lipasa
se demuestra por una coloración azul alrededor de las colonias.
PRUEBA DEL MALONATO
Pone de manifiesto la capacidad que poseen determinadas bacterias de utilizar el
malonato de sodio como única fuente de carbono, con la consiguiente liberación
del catión, que en presencia de iones agua produce alcalinidad.
Medio de cultivo
Fórmula en g/l de agua destilada:
– Extracto de levadura: 1g.
– Sulfato amónico: 2 g.
– Fosfato potásico: 0,6 g.
– Fosfato monopotásico: 0,4 g.
– Cloruro sódico: 2 g.
– Malonato de sodio: 3 g.
– Glucosa: 0,25 g.
– Azul de bromotimol: 0,025 g.
– pH: 6,7.
Preparar el medio e intubar a razón de 3 ml por tubo. Esterilizar en autoclave.
Inoculación
Inocular el caldo con un inóculo poco denso.
Incubación
Incubar a 35-37° C durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas.
Interpretación de los resultados
En caso de utilización del malonato, se aprecia crecimiento (turbidez) y un
cambio de color verde a azul prusia intenso. Si el resultado es negativo, se mantiene
el color verde original.
PRUEBA DE LA MOVILIDAD
La movilidad es una característica importante al hacer una determinación
bacteriana, pues indirectamente señala que el microorganismo posee flagelos,
rasgo taxonómico que es difícil poner de manifiesto por otros métodos,
incluidos los tintoriales.
Existen varias técnicas que permiten demostrar la movilidad bacteriana. Entre
ellas destacamos:
a) Las que se visualizan microscópicamente. b) Las que se observan por cultivo
en medios semisólidos.
a) Por observación microscópica
1. Entre porta y cubre
Consiste en depositar una gota de cultivo en medio líquido, o la suspensión
de una colonia en suero fisiológico, sobre un portaobjetos. Colocar un cubre
encima y mirar al microscopio utilizando objetivo seco de gran aumento.
Esta técnica se puede utilizar para microorganismos anaerobios, siempre que
se efectúe con rapidez y se observe la porción central del montaje.
Presenta el inconveniente, para observadores poco expertos, de confundir el movimiento
activo de la célula con el movimiento pasivo browniano.
2. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de suspensión bacteriana en el centro de un cubreobjetos,
depositando además vaselina sólida en sus cuatro extremos. Seguidamente
se coloca un portaobjetos excavado o de Koch sobre el cubre, de modo que la gota
quede en la concavidad del portaobjetos. Después se le da la vuelta, con lo
que la gota queda suspendida. La observación se hace de igual forma que la
anterior y presenta el mismo inconveniente.
3. En tubo capilar cerrado
Las bacterias anaerobias pueden observarse en fresco llenando un tubo capilar con
una suspensión y cerrando inmediatamente los dos extremos con plastilina.
El capilar se observa al microscopio con objetivo de 40 X aumentos. Tiene el mismo
inconveniente que los anteriores.
b) Por cultivo en medio semisólido
Los medios de cultivo para la observación de la movilidad contienen 0,4 por
100 de agar, lo que permite ver el desplazamiento de las bacterias, si existe.
Medio de cultivo
El medio de cultivo más recomendado es el de Edwars-Ewing, ya que permite
el crecimiento de muchas bacterias.
Fórmula en g/l de agua destilada:
– Peptona: 10 g.
– Extracto de carne: 3 g.
– Cloruro sódico: 5 g.
– Agar: 4 g.
El medio se prepara de forma convencional, calentando los componentes hasta solubilizarlos.
Se distribuye en tubos, se esteriliza en autoclave y se deja enfriar en posición
vertical.
Para observar mejor el desplazamiento de los microorganismos aerobios se puede añadir
al medio 100 µg/ml de cloruro de trifeniltetrazolio, que se reduce a formazán
por acción de las deshidrogenasas bacterianas, quedando de color rojo la zona
donde haya crecimiento. Sin embargo, las sales de trifeniltetrazolio pueden actuar
inhibiendo el crecimiento de algunas bacterias muy exigentes.
Inoculación
Se siembra por picadura en el centro del medio, introduciendo la aguja con cuidado
hasta unos 0,6 cm del fondo y extrayéndola siguiendo el mismo recorrido de
entrada.
Incubación
La temperatura de incubación dependerá de la bacteria estudiada, ya
que muchos organismos no son móviles a su temperatura óptima de crecimiento
(35-37° C) y lo son a 18-25° C.
Se deben inocular dos tubos simultáneamente, incubando uno a 35-37° C
y, el otro, a 22-25° C realizando lecturas diarias durante diez días.
Interpretación de los resultados
El test de movilidad se interpreta por un examen macroscópico del medio. Si
el microorganismo es móvil, se producirá una zona de difusión
del crecimiento a los lados de la línea de inoculación. Si la bacteria
es inmóvil, crecerá sobre la línea de siembra.
Hay algunos medios de cultivo de identificación que permiten observar, además
de una o dos pruebas bioquímicas, si el microorganismo sembrado es móvil
o no. Entre ellas destacamos el sulfhídrico-indol-movilidad, el movilidad-
indol-ornitina y el manitol-movilidad-nitrato. En ellos la movilidad se interpretará
antes de adicionar los reactivos.
REACCION DE NAGLER
La reacción de Nagler pone de manifiesto la producción de alfa-toxina
(lecitinasa) por determinadas especies de Clostridium.
Medio de cultivo
Se utiliza el agar yema de huevo, su composición se detalla en la prueba de
la lecitinasa.
Inoculación
Antes de inocular la placa de agar yema de huevo se divide ésta en dos partes
iguales, depositando en una de ellas dos gotas de antitoxina de Clostridium perfringens
tipo A, que se distribuyen con un hisopo. Dejar secar y estriar el inóculo
perpendicularmente a la línea de división, a través de ambas
mitades de la placa, comenzando sobre la mitad sin antitoxina.
Incubación
Incubar a 35-37° C en anaerobiosis, durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas.
Interpretación de los resultados
Si el microorganismo es productor de lecitinasa, se observará una zona opaca
alrededor de las colonias desarrolladas en la mitad de la placa exenta de antitoxina.
En la zona que contiene antitoxina, dicho halo quedará inhibido.
PRUEBA DE LA NIACINA
La prueba de la niacina pone de manifiesto la producción de ácido nicotínico
por las Micobacterias. La niacina se forma en todas las Micobacterias pero la mayoría
de las especies poseen una enzima que transforma la niacina libre en niacina ribonucleótida,
en cambio algunas especies, como Mycobacterium tuberculosis, carecen de esta
enzima, por lo que dan lugar a la acumulación de niacina en el medio de cultivo.
Medio de cultivo
Se utiliza Löwenstein-Jensen. Este medio contiene asparagina, a partir de la
cual las Micobacterias producen ácido nicotínico.
Reactivos
-Solución de anilina al 4 por 100 en alcohol de 90° C.
La solución se prepara mezclando 4 ml de anilina incolora con 96 ml de etanol
al 95 por 100. La mezcla se debe preparar en el momento de utilizarla.
– Solución de bromuro de cianógeno al 10 por 100 en agua destilada.
Disolver 5 g de bromuro de cianógeno en 50 ml de agua destilada.
La solución se debe conservar en un frasco color topacio cerrado herméticamente,
a 4° C, de esta forma se puede utilizar durante cinco o seis meses.
El bromuro de cianógeno es altamente tóxico, por lo que se debe manipular
con precaución. Se puede adquirir comercializado.
Si la solución de bromuro de cianógeno presenta precipitado, calentar
a temperatura ambiente y redisolver antes de usarla.
Inoculación
Sembrar la muestra en Löwenstein-Jensen.
Incubación
Incubar a 35-37° C hasta lograr un crecimiento abundante. Los cultivos deben
contener un mínimo de 50 colonias para lo que será necesario prolongar
la incubación durante varias semanas. Si los cultivos presentan menor número
de colonias, pueden no haber producido suficiente ácido nicotínico.
Interpretación de los resultados
La niacina debe extraerse del medio de cultivo, por lo que si hay un crecimiento
que cubre el medio, se debe arrastrar con el asa parte del cultivo con el fin de
que el líquido de extracción pueda entrar en contacto directo con el
medio de cultivo.
A continuación añadir sobre el cultivo, 1 ml de agua destilada estéril
y mantener el tubo en posición horizontal durante veinte-treinta minutos,
de forma que el agua cubra la superficie del medio, y se efectúe la extracción
del ácido nicotínico.
Pasar el líquido a un tubo de hemólisis y añadir sobre el mismo
0,5 ml de la solución de anilina. Dejar en reposo uno-dos minutos y agregar
0,5 ml de la solución de bromuro de cianógeno.
Se considera prueba positiva a la aparición de color amarillo intenso en pocos
minutos, que comienza en la interfase de los dos reactivos y se extiende luego a
todo el líquido.
La prueba será negativa si el líquido permanece incoloro o se forma
un precipitado blanquecino.
La prueba de la niacina también se puede efectuar realizando toda la prueba
en el interior del tubo de cultivo, para lo que se añade directamente la solución
de anilina sobre el medio, dejado reposar el tubo en posición horizontal durante
diez-veinte minutos y añadiendo, posteriormente, la solución de bromuro
de cianógeno. La lectura se efectuará inmediatamente, considerando
como reacción positiva la presencia de colonias amarillo-oro que destacan
claramente sobre el fondo verde del Löwenstein-Jensen. El líquido presentará
un color verde-amarillento o amarillo.
Si la reacción es negativa, las colonias no estarán pigmentadas de
amarillo, el líquido tendrá color verde.
PRUEBA DE REDUCCION DEL NITRATO
Algunos microorganismos utilizan el nitrato en una vía alternativa como fuente
de energía, reduciéndolo a nitrito o a nitrógeno libre. Esta
propiedad es una característica importante en la diferenciación de
muchos grupos bacterianos.
La presencia de nitrito en el medio se demuestra añadiendo alfa-naftilamina
y ácido sulfanílico, con la formación de un compuesto rojo:
el parasulfobencenoazo-alfa-naftilamina.
Medio de cultivo
Se utiliza caldo nutritivo adicionado de nitrato potásico.
Fórmula en g/l de agua destilada:
– Extracto de carne: 3 g.
– Peptona: 5 g.
– Nitrato potásico: 1 g.
– pH: 7.
Preparar el medio y calentar hasta disolución. Distribuir en tubos a razón
de 5 ml por tubo, y esterilizar en autoclave.
Reactivos
Reactivo A:
– Alfa-naftilamina: 5 g.
– Acido acético 5N al 30 por 100: 1.000 ml.
Reactivo B:
– Acido sulfanílico: 8 g.
– Acido acético 5N al 30 por 100: 1.000 ml.
Mantener los reactivos A y B en frasco oscuro y en nevera.
Inoculación
Realizar un inóculo denso en el caldo.
Incubación
Incubar a 35-37° C durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas.
Interpretación de los resultados
Añadir 0,5 ml de reactivo A y a continuación 0,5 ml del reactivo B.
La aparición de un color rojo después de treinta segundos indica la
presencia de nitritos en el medio.
La reducción de los nitratos puede dar otros productos más reducidos
como amoniaco, nitrógeno molecular, óxido nítrico, óxido
nitroso o hidroxilamina, dependiendo de la especie bacteriana, en tal caso, después
de la adición del reactivo, no se aprecia cambio de color en el medio.
Para confirmar que el proceso es negativo es necesario añadir una pequeña
cantidad de polvo de zinc, el cual, en caso de que existan nitratos, los reducirá
a nitritos, volviendo el medio de color rojo, e indicando consecuentemente que antes
no se había producido la reacción. Si después de la adición
del polvo de zinc el color no vira a rojo, indica que ha habido reducción
y que el producto obtenido no ha sido el nitrito.
PRUEBA DE REDUCCION DE NITRATO PARA ANAEROBIOS
La prueba de reducción del nitrato para microorganismos anaerobios tiene el
mismo fundamento y realización que el método descrito para aerobios,
siendo el medio recomendado para realizar el ensayo el indol-nitrito y realizando
la incubación del mismo, una vez inoculado, a 35-37° C en anaerobiosis,
hasta que se observe un crecimiento abundante.
Medio Indol-nitrito
Fórmula en g/l de agua destilada:
– Peptona trípsica de caseína: 20 g.
– Fosfato disódico: 2 g.
– Glucosa: 1 g.
– Agar: 1 g.
– Nitrato potásico: 1 g.
– pH: 7,2.
Preparar el medio y calentar hasta disolución. Distribuir en tubos a razón
de 5 ml en cada uno y esterilizar en autoclave.
Una vez fríos los tubos mantenerlos en ambiente anaeróbico durante
un cierto tiempo. Si no se dispone de cámara anaeróbica se puede hervir
el medio con los tapones aflojados, durante diez minutos, enfriar e inocular inmediatamente.
PRUEBA DE REDUCCION DE NITRATO PARA MICOBACTERIAS
El fundamento de esta prueba es el mismo que el ya descrito para otros microorganismos.
Medio de cultivo
Se utiliza una solución de nitrato:
– Nitrato sódico: 0,425 g.
– Tween 80: 4ml.
– Agua destilada: 1.000 ml.
Reactivos
Se utiliza el reactivo A y el reactivo B descritos en la prueba para aerobios.
Inoculación
A partir de un cultivo joven, emulsionar un asa de colonias en un tubo de hemólisis
con 2 ml de la solución de nitrato.
Incubación
Incubar a 35-37° C durante dos a cuatro horas.
Interpretación de los resultados
Añadir una gota del reactivo A y otra del reactivo B. La aparición
de un color rosa-rojo en treinta-sesenta segundos, indica la presencia de nitritos
en el medio. La prueba será negativa si no hay aparición de color.
Si no se ha producido coloración se debe confirmar que la prueba es negativa
añadiendo una pequeña cantidad de polvo de zinc. Si se produce color
rojo, la prueba es realmente negativa, pero si no hay cambio de color, la prueba
será positiva, ya que los nitratos han sido reducidos a compuestos incoloros.
PRUEBA DE LA SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
Los Staphylococcus coagulasa negativos pueden diferenciarse en dos grupos,
según sean sensibles o no a la novobiocina
(5 µg).
Staphylococcus epidermidis es sensible, mientras que Staphylococcus saprophyticus
no lo es.
Medio de cultivo
Se utiliza el mismo medio que el recomendado para la técnica del antibograma,
es decir, el agar Mueller-Hinton.
Reactivo
Disco de novobiocina de 5 µg., que puede adquirirse comercializado.
Inoculación
Inocular superficialmente una placa de agar Mueller- Hinton con una suspensión
de microorganismos de concentración análoga a la utilizada para los
antibiogramas.
Dejar reposar quince minutos a temperatura ambiente y depositar en el centro de la
placa un disco de novobiocina.
Incubación
Incubar a 35-37° C durante veinticuatro horas.
Interpretación de los resultados
Se considera al Staphylococcus sensible a la novobiocina cuando el halo de
inhibición de crecimiento sea superior a 16 mm.
SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA••
El clorhidrato de etilhidroxicupreína (optoquina) inhibe a muy baja concentración
(5 µg/ml o menos) el crecimiento de Streptococcus pneumoniae, mientras
que no afecta a otros Streptococcus alfa-hemolíticos o sus halos son
inferiores a 15 mm.
Medio de cultivo
El medio de cultivo utilizado, es el agar-sangre de carnero al 5 por 100.
Reactivo
Disco de optoquina de 5 µg., que puede adquirirse comercialmente.
Inoculación
Empapar un hisopo con una suspensión del Streptococcus problema procedente
de un cultivo de veinticuatro horas e inocular una placa de agar sangre, pasándolo
bien por toda su superficie. Dejar reposar a temperatura ambiente durante diez minutos
y añadir con unas pinzas estériles el disco de optoquina, presionándolo
para favorecer su contacto con el medio. Hay autores que aconsejan añadir
sobre el disco una gota de agua destilada estéril, pues con ello se favorece
un aumento del halo de inhibición en unos 2 mm.
Incubación
Incubar a 35-37° C durante dieciocho-veinticuatro horas en una atmósfera
enriquecida con un 2 a un 3 por 100 de C02. Los métodos que proporcionan un
mayor aumento de C02 no son recomendables, pues pueden modificar el halo de inhibición.
Interpretación de los resultados
El crecimiento de Streptococcus pneumoniae queda inhibido en más de
15 mm alrededor del disco de optoquina. Los demás Streptococcus alfa-hemolíticos
no presentan ningún tipo de inhibición o sus halos son inferiores a
15 mm.
Si la zona de inhibición es inferior a 15 mm, es aconsejable confirmar que
es un neumococo con la prueba de solubilidad en bilis.
PRUEBA DE OXIDACION-FERMENTACION (O-F)
Pone de manifiesto la propiedad que tienen determinados microorganismos de actuar
sobre los hidratos de carbono por vía oxidativa o fermentativa. Las bacterias
que no presentan actividad sobre los glúcidos, dan esta prueba negativa.
Medio de cultivo
El utilizado es el medio básico de Hugh y Leifson.
Fórmula en g/l de agua destilada:
– Peptona: 2 g.
– Cloruro sódico: 5 g.
– Fosfato dipotásico: 0,3 g.
– Agar: 2,5 g.
– Azul de bromotimol: 0,03 g.
– pH: 7,1.
Una vez preparado y esterilizado el medio, dejar enfriar a unos 50° C y añadir
en condiciones asépticas, 100 ml de una solución de glucosa (o del
carbohidrato que se desee) al 10 por 100, previamente esterilizado por filtración.
Repartir en tubos y dejar enfriar en posición vertical.
Separar los tubos en dos lotes y añadir superficialmente a todos los de un
grupo, una capa de 1 cm de parafina líquida estéril.
Inoculación
Inocular por picadura hasta 1/2 cm del fondo del tubo. Para cada microorganismo se
siembran dos tubos, uno de los cuales contiene parafina.
Incubación
Incubar a 35-37° C durante cuarenta y ocho horas o más.
Interpretación de los resultados
Los tubos se observan diariamente hasta los catorce días. El viraje de color
azul verdoso a amarillo, indica que el microorganismo ha producido acidez a partir
del azúcar. Si dicha coloración aparece solamente en el tubo que no
está cubierto con parafina, diremos que el microorganismo actúa sobre
la glucosa (o el azúcar utilizado) de forma oxidativa (0). Si se manifiesta
en ambos, diremos que el germen es fermentativo (F).
PRUEBA DE LA OXIDASA••
Pone de manifiesto la presencia de enzima oxidasa en ciertos microorganismos. La
oxidasa o citocromooxidasa es una enzima que cede electrones (H2), de un substrato
al oxígeno, en el tren de transporte electrónico.
Reactivo
Pueden utilizarse diversos reactivos, que son colorantes que actúan como aceptores
de electrones, pasando en este caso de forma incolora o poco coloreada, a fuertemente
teñida.
El reactivo más utilizado es el clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina
al 1 por 100 en agua (reactivo de Kovacs).
Existen comercializados discos o tiras de papel impregnadas de reactivos para el
diagnóstico de oxidasa.
Método
Colocar un trozo de papel de filtro Whatman núm. 1, dentro de una placa de
Petri y añadirle dos-tres gotas de reactivo. Con un asa de platino (que no
sea de hierro, ya que puede dar falsos positivos), coger una colonia de veinticuatro
horas, y extenderla sobre el papel de filtro mojado.
Interpretación de los resultados
La aparición de una coloración púrpura sobre la línea
de inoculación se considera como reacción positiva. Si no hay cambio
de coloración, la prueba es negativa.
PRODUCCION DE PIGMENTOS
Esta prueba permite diferenciar especies de Pseudomonas al poner de manifiesto
sus pigmentos específicos.
Medios de cultivo
Los medios utilizados son el King A (o P), y el King B (o F). El King A favorece
la producción de piocianina y el King B la de fluoresceína.
Fórmula en g/l de agua destilada:
King A
– Peptona de gelatina: 20 g.
– Glicerol: 10 g.
– Sulfato anhidro de potasio: 10 g.
– Cloruro anhidro de magnesio: 1,4 g.
– Agar: 15 g.
– pH: 7,2.
King B
– Proteosa peptona: 20 g.
– Glicerol: 10 g.
– Fosfato bipotásico anhidro: 1,5 g.
– Sulfato de magnesio (7 H20): 1,5 g.
– Agar: 15 g.
Preparar el medio, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave. Dejar enfriar
en posici6n inclinada.
Inoculación
Con un cultivo joven sembrar, en el pico de flauta, los dos medios: el A y el B.
Incubación
Incubar a 30-32°C de uno a cinco días.
Interpretación de los resultados
King A
La presencia de una coloración azulada, se considera como positiva. Si posee
otro color se debe confirmar la presencia de piocianina en la mezcla, extrayéndola
con 0,5-1 ml de cloroformo. En caso positivo el disolvente se vuelve de color azul,
y si se añaden unas gotas de HCI vira rápidamente a rojo.
King B
La presencia de fluoresceína se hace comprobando la fluorescencia (color verde
manzana) bajo la lámpara de Wood, comparando con un tubo sin inocular.
PRODUCCION DE PIGMENTOS POR MICOBACTERIAS
La producción de pigmento es una prueba útil para la identificación
de Micobacterias, ya que atendiendo a esta característica se pueden clasificar
en tres grupos:
Primer grupo: Micobacterias escotocromógenas. Son las que producen pigmento
en presencia de luz y en la oscuridad, siendo normalmente más acentuado dicho
pigmento en el primer caso.
Segundo caso: Micobacterias fotocromógenas. Sólo producen pigmento
en presencia de luz.
Tercer grupo: Micobacterias no cromógenas. No producen pigmento con
luz ni en la oscuridad.
Método
Exponer los cultivos desarrollados, en medio de Löwenstein, a la luz de una
lámpara de 60 watios, a 50 ó 60 cm de distancia de la fuente luminosa,
y con el tapón del tubo de cultivo aflojado para facilitar la oxigenación
de las colonias. Mantener la exposición durante una hora.
Incubar de nuevo el cultivo de dieciocho a veinticuatro horas.
Utilizar como control un cultivo de la misma cepa envuelto en papel de aluminio,
incubado en las mismas condiciones y que no haya tenido contacto alguno con la luz.
Interpretación de los resultados
Se considera la cepa como fotocromógena, cuando el cultivo mantenido en la
oscuridad no presenta pigmentación y en cambio las colonias del tubo expuesto
a la luz si la muestran, después de la posterior incubación de veinticuatro
horas.
PRUEBA DE LA PIRAZINAMIDA (PZA)
Esta prueba pone de manifiesto la capacidad que tienen ciertas Micobacterias de producir
la desaminación de la pirazinamida a ácido pirazinoico.
Medio de cultivo
– Caldo base de Dubos: 1 l.
– Pirazinamida: 0,1 g.
– Piruvato s6dico: 2 g.
– Agar: 15 g.
Dispensar en tubos a razón de 15 ml cada uno. Esterilizar en autoclave y dejar
enfriar en posición vertical.
Caldo base de Dubos
Fórmula por l de agua destilada:
– Casitona: 0,5 g.
– Asparagina: 2 g.
– Tween 80: 0,2 g.
– Fosfato monopotásico: 1 g.
– Fosfato disódico: 2,5 g.
– Citrato amónico férrico: 50 mg.
– Sulfato magnésico: 10 mg.
– Cloruro cálcico: 0,5 mg.
– Su Ifato de zinc: 0,1 mg.
– Sulfato de cobre: 0,1 mg.
– pH: 6,6.
Reactivo
Solución acuosa al 1 por 100 de sulfato férrico amónico.
Inoculación
A partir de un cultivo joven, realizar un inóculo abundante en dos tubos de
medio.
Incubación
Incubar a 35-37° C durante cuatro días. Al cabo de este tiempo, añadir
a uno de los tubos 1 ml de la solución acuosa de sulfato férrico amónico
e incubar a 5° C durante cuatro horas.
Interpretación de los resultados
Se considera la prueba positiva si aparece color rosa sobre la superficie del agar,
que pasado el tiempo, tiende a difundirse por todo el medio. La observación
debe realizarse con luz incidente. Si la prueba es negativa, repetir al cabo de siete
días con el otro tubo que habrá permanecido en incubación.