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3º TEXTO





PRODUCCION DE INDOL POR ANAEROBIOS

La prueba de producción de indol para anaerobios se puede realizar por el sistema clásico de la prueba en tubo o mediante la reacción de la «mancha de indol».

Prueba en tubo

Se utiliza el medio descrito para microorganismos aerobios o el medio indol-nitrito, usando entonces como reactivo para poner en evidencia la producción de indol, el de Ehrlich.

La inoculación se realiza de la misma forma que para las bacterias aerobias, incubando los tubos a 35-37° C, en anaerobiosis durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas. A continuación se pasan a un tubo de ensayo 2 ml de caldo de cultivo que presente un buen crecimiento y se añade sobre el mismo 1 ml de xileno. Mezclar y dejar en reposo por lo menos dos minutos. Agregar por las paredes del tubo 0,5 ml de reactivo de Ehrlich.

Se considera como prueba positiva la aparición de un anillo de color rosa en unos diez a quince minutos. En caso negativo se formará un anillo de color amarillo.

Prueba de la mancha de indol


Se realiza a partir de un cultivo en agar sangre, preparado con un medio base que contenga triptófano.

Tomar con un asa una o más colonias y extenderlas sobre papel de filtro humedecido previamente con una solución preparada de la siguiente forma: 1g de p- dimetilaminocinnamaldehído en 100 ml de ácido clorhídrico diluido (10ml de ácido clorhídrico concentrado y 90 ml de agua destilada).

Se considera como prueba positiva la aparición inmediata de coloración azul o azul verdosa alrededor de la extensión.

Si no hay cambio de color, cualquier otro color o la aparición tardía del mismo, se interpretarán como prueba negativa.

FENOMENO DE KANAGAWA

Se conoce como fenómeno de Kanagawa la capacidad de la especie Vibrio parahaemolyticus de producir hemólisis en hematíes de sangre humana o de conejo.

Medio de cultivo

Se utiliza agar de Wagatsuma.

Inoculación

Inocular la superficie del agar en manchitas.

Incubación


Incubar a 35-37° C durante veinticuatro horas.

Interpretación de los resultados

La prueba se considera positiva si aparece betahemólisis en el medio (Kanagawa positivo).

PRUEBA DE LA LECITINASA

La prueba de la lecitinasa pone de manifiesto la producción de dicha enzima por determinados microorganismos, capaces de actuar sobre la lecitina, sustancia orgánica nitrogenada y fosfatada, contenida principalmente en la yema de huevo.

Medio de cultivo

Se utiliza el agar yema de huevo.

Fórmula en g/l de agua destilada:


Tripticasa: 40 g.
Fosfato disódico: 5 g.
Cloruro sódico: 2 g.
Sulfato de magnesio al 5 por 100: 0,2 ml.
Glucosa: 2 g.
Agar: 25 g.
pH: 7,3-7,4.

Una vez preparado y autoclavado el medio, enfriar a 55-60° C. Añadir en condiciones asépticas una emulsión estéril de yema de huevo, mezclando hasta obtener una suspensión homogénea y repartir en placas.

Inoculación

A partir de un cultivo joven, efectuar una siembra en aislamiento.

Incubación

Incubar a 35-37° C, en anaerobiosis, durante cuarenta y ocho horas.

Interpretación de los resultados


Las colonias productoras de lecitinasa, forman una zona opaca a su alrededor, que se aprecia mejor con iluminación oblicua.

En la práctica la visualización de la zona opaca no suele ser fácil, por lo que se recomienda realizar la prueba de Nagler.

PRUEBA DE LA LECHE CON TORNASOL

Se basa en la capacidad de ciertos microorganismos de producir determinadas reacciones metabólicas en medios con leche. Estas reacciones se ponen de manifiesto mediante un indicador redox y de pH, como el tornasol.

Medio de cultivo

Se utiliza el medio de la leche tornasolada pH = 6,8, que permite determinar: fermentación de la lactosa, caseolisis (peptonización), y coagulación de la caseína.

Fórmula en g/l de agua destilada:

Leche descremada deshidratada: 100 g.
Polvo tornasol: 0,75 g.

Mezclar los componentes calentando suavemente hasta disolución. Añadir pequeñas cantidades de tornasol hasta lograr un pH de 6,8. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave.

Durante el autoclavado la leche tornasolada se reduce a una base de color blanco, que al enfriarse absorbe oxígeno y vuelve al color púrpura inicial.

Inoculación

Inocular los tubos a partir de un cultivo joven.

Incubación

Incubar a 35-37° C en aerobiosis o anaerobiosis, según el microorganismo estudiado, durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas. Pueden ser necesarios períodos de incubación más largos.

Interpretación de los resultados

Color rosado en el medio de cultivo: Fermentación de la lactosa. La reacción es ácida.

No hay cambio de color en el medio de cultivo: No se ha producido fermentación de la lactosa ni utilización de sustancias nitrogenadas del medio.

Color azul en el medio de cultivo: No hay fermentación de la lactosa, pero el microorganismo ha utilizado las sustancias nitrogenadas del medio, produciendo reacción alcalina.

Color blanco en el medio de cultivo: El color blanco indica que se ha producido una peptonización de la proteína de la leche (digestión). El tornasol se reduce a una leucobase.

Producción de coágulo: Su presencia indica coagulación de la leche.

Producción de gas: La aparición de burbujas en el medio indica la producción de gas (C02 y H2).

PRUEBA DE LA LIPASA

Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias de descomponer las grasas en ácidos grasos y glicerol, por acción de la enzima lipasa.

Medio de cultivo

Se utiliza el agar yema de huevo, cuya composición se detalla en la prueba de la lecitinasa.

Inoculación

Sembrar una colonia aislada en agar yema de huevo. Conviene utilizar placas guardadas en jarras de anaerobiosis, por lo menos cuatro horas antes de su uso.

Incubación

Incubar a 35-37° C en anaerobiosis, durante cuarenta y ocho horas.

Interpretación de los resultados

Una reacción lipasa positiva está indicada por un brillo oleoso, iridiscente o nacarado sobre la superficie del crecimiento. Se debe observar la placa con iluminación indirecta (luz oblicua).

La reacción puede ser retardada, por lo que se deben conservar las placas durante una semana, antes de darlas como negativas.

Con frecuencia el aspecto del halo formado alrededor de las colonias, puede confundirse con la producción de lecitinasa. Para diferenciar ambas pruebas se utiliza un revelado que consiste en añadir sobre la placa, una solución saturada de sulfato de cobre. Se deja reposar veinte minutos y se elimina el exceso. A continuación se incuban las placas a 35-37° C. durante unos minutos. La presencia de lipasa se demuestra por una coloración azul alrededor de las colonias.

PRUEBA DEL MALONATO

Pone de manifiesto la capacidad que poseen determinadas bacterias de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono, con la consiguiente liberación del catión, que en presencia de iones agua produce alcalinidad.

Medio de cultivo

Fórmula en g/l de agua destilada:

Extracto de levadura: 1g.
Sulfato amónico: 2 g.
Fosfato potásico: 0,6 g.
Fosfato monopotásico: 0,4 g.
Cloruro sódico: 2 g.
Malonato de sodio: 3 g.
Glucosa: 0,25 g.
Azul de bromotimol: 0,025 g.
pH: 6,7.

Preparar el medio e intubar a razón de 3 ml por tubo. Esterilizar en autoclave.

Inoculación

Inocular el caldo con un inóculo poco denso.

Incubación

Incubar a 35-37° C durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas.

Interpretación de los resultados

En caso de utilización del malonato, se aprecia crecimiento (turbidez) y un cambio de color verde a azul prusia intenso. Si el resultado es negativo, se mantiene el color verde original.

PRUEBA DE LA MOVILIDAD

La movilidad es una característica importante al hacer una determinación bacteriana, pues indirectamente señala que el microorganismo posee flagelos, rasgo taxonómico que es difícil poner de manifiesto por otros métodos, incluidos los tintoriales.

Existen varias técnicas que permiten demostrar la movilidad bacteriana. Entre ellas destacamos:

a) Las que se visualizan microscópicamente. b) Las que se observan por cultivo en medios semisólidos.

a) Por observación microscópica

1. Entre porta y cubre

Consiste en depositar una gota de cultivo en medio líquido, o la suspensión de una colonia en suero fisiológico, sobre un portaobjetos. Colocar un cubre encima y mirar al microscopio utilizando objetivo seco de gran aumento.

Esta técnica se puede utilizar para microorganismos anaerobios, siempre que se efectúe con rapidez y se observe la porción central del montaje. Presenta el inconveniente, para observadores poco expertos, de confundir el movimiento activo de la célula con el movimiento pasivo browniano.

2. Gota pendiente

Consiste en colocar una gota de suspensión bacteriana en el centro de un cubreobjetos, depositando además vaselina sólida en sus cuatro extremos. Seguidamente se coloca un portaobjetos excavado o de Koch sobre el cubre, de modo que la gota quede en la concavidad del portaobjetos. Después se le da la vuelta, con lo que la gota queda suspendida. La observación se hace de igual forma que la anterior y presenta el mismo inconveniente.

3. En tubo capilar cerrado

Las bacterias anaerobias pueden observarse en fresco llenando un tubo capilar con una suspensión y cerrando inmediatamente los dos extremos con plastilina. El capilar se observa al microscopio con objetivo de 40 X aumentos. Tiene el mismo inconveniente que los anteriores.

b) Por cultivo en medio semisólido

Los medios de cultivo para la observación de la movilidad contienen 0,4 por 100 de agar, lo que permite ver el desplazamiento de las bacterias, si existe.

Medio de cultivo

El medio de cultivo más recomendado es el de Edwars-Ewing, ya que permite el crecimiento de muchas bacterias.

Fórmula en g/l de agua destilada:


Peptona: 10 g.
Extracto de carne: 3 g.
Cloruro sódico: 5 g.
Agar: 4 g.

El medio se prepara de forma convencional, calentando los componentes hasta solubilizarlos. Se distribuye en tubos, se esteriliza en autoclave y se deja enfriar en posición vertical.

Para observar mejor el desplazamiento de los microorganismos aerobios se puede añadir al medio 100 µg/ml de cloruro de trifeniltetrazolio, que se reduce a formazán por acción de las deshidrogenasas bacterianas, quedando de color rojo la zona donde haya crecimiento. Sin embargo, las sales de trifeniltetrazolio pueden actuar inhibiendo el crecimiento de algunas bacterias muy exigentes.

Inoculación

Se siembra por picadura en el centro del medio, introduciendo la aguja con cuidado hasta unos 0,6 cm del fondo y extrayéndola siguiendo el mismo recorrido de entrada.

Incubación

La temperatura de incubación dependerá de la bacteria estudiada, ya que muchos organismos no son móviles a su temperatura óptima de crecimiento (35-37° C) y lo son a 18-25° C.

Se deben inocular dos tubos simultáneamente, incubando uno a 35-37° C y, el otro, a 22-25° C realizando lecturas diarias durante diez días.

Interpretación de los resultados

El test de movilidad se interpreta por un examen macroscópico del medio. Si el microorganismo es móvil, se producirá una zona de difusión del crecimiento a los lados de la línea de inoculación. Si la bacteria es inmóvil, crecerá sobre la línea de siembra.

Hay algunos medios de cultivo de identificación que permiten observar, además de una o dos pruebas bioquímicas, si el microorganismo sembrado es móvil o no. Entre ellas destacamos el sulfhídrico-indol-movilidad, el movilidad- indol-ornitina y el manitol-movilidad-nitrato. En ellos la movilidad se interpretará antes de adicionar los reactivos.

REACCION DE NAGLER

La reacción de Nagler pone de manifiesto la producción de alfa-toxina (lecitinasa) por determinadas especies de Clostridium.

Medio de cultivo

Se utiliza el agar yema de huevo, su composición se detalla en la prueba de la lecitinasa.

Inoculación

Antes de inocular la placa de agar yema de huevo se divide ésta en dos partes iguales, depositando en una de ellas dos gotas de antitoxina de Clostridium perfringens tipo A, que se distribuyen con un hisopo. Dejar secar y estriar el inóculo perpendicularmente a la línea de división, a través de ambas mitades de la placa, comenzando sobre la mitad sin antitoxina.

Incubación

Incubar a 35-37° C en anaerobiosis, durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas.

Interpretación de los resultados

Si el microorganismo es productor de lecitinasa, se observará una zona opaca alrededor de las colonias desarrolladas en la mitad de la placa exenta de antitoxina. En la zona que contiene antitoxina, dicho halo quedará inhibido.

PRUEBA DE LA NIACINA

La prueba de la niacina pone de manifiesto la producción de ácido nicotínico por las Micobacterias. La niacina se forma en todas las Micobacterias pero la mayoría de las especies poseen una enzima que transforma la niacina libre en niacina ribonucleótida, en cambio algunas especies, como Mycobacterium tuberculosis, carecen de esta enzima, por lo que dan lugar a la acumulación de niacina en el medio de cultivo.

Medio de cultivo

Se utiliza Löwenstein-Jensen. Este medio contiene asparagina, a partir de la cual las Micobacterias producen ácido nicotínico.

Reactivos

-Solución de anilina al 4 por 100 en alcohol de 90° C.

La solución se prepara mezclando 4 ml de anilina incolora con 96 ml de etanol al 95 por 100. La mezcla se debe preparar en el momento de utilizarla.

Solución de bromuro de cianógeno al 10 por 100 en agua destilada.

Disolver 5 g de bromuro de cianógeno en 50 ml de agua destilada.

La solución se debe conservar en un frasco color topacio cerrado herméticamente, a 4° C, de esta forma se puede utilizar durante cinco o seis meses.

El bromuro de cianógeno es altamente tóxico, por lo que se debe manipular con precaución. Se puede adquirir comercializado.

Si la solución de bromuro de cianógeno presenta precipitado, calentar a temperatura ambiente y redisolver antes de usarla.

Inoculación

Sembrar la muestra en Löwenstein-Jensen.

Incubación

Incubar a 35-37° C hasta lograr un crecimiento abundante. Los cultivos deben contener un mínimo de 50 colonias para lo que será necesario prolongar la incubación durante varias semanas. Si los cultivos presentan menor número de colonias, pueden no haber producido suficiente ácido nicotínico.

Interpretación de los resultados

La niacina debe extraerse del medio de cultivo, por lo que si hay un crecimiento que cubre el medio, se debe arrastrar con el asa parte del cultivo con el fin de que el líquido de extracción pueda entrar en contacto directo con el medio de cultivo.

A continuación añadir sobre el cultivo, 1 ml de agua destilada estéril y mantener el tubo en posición horizontal durante veinte-treinta minutos, de forma que el agua cubra la superficie del medio, y se efectúe la extracción del ácido nicotínico.

Pasar el líquido a un tubo de hemólisis y añadir sobre el mismo 0,5 ml de la solución de anilina. Dejar en reposo uno-dos minutos y agregar 0,5 ml de la solución de bromuro de cianógeno.

Se considera prueba positiva a la aparición de color amarillo intenso en pocos minutos, que comienza en la interfase de los dos reactivos y se extiende luego a todo el líquido.

La prueba será negativa si el líquido permanece incoloro o se forma un precipitado blanquecino.

La prueba de la niacina también se puede efectuar realizando toda la prueba en el interior del tubo de cultivo, para lo que se añade directamente la solución de anilina sobre el medio, dejado reposar el tubo en posición horizontal durante diez-veinte minutos y añadiendo, posteriormente, la solución de bromuro de cianógeno. La lectura se efectuará inmediatamente, considerando como reacción positiva la presencia de colonias amarillo-oro que destacan claramente sobre el fondo verde del Löwenstein-Jensen. El líquido presentará un color verde-amarillento o amarillo.

Si la reacción es negativa, las colonias no estarán pigmentadas de amarillo, el líquido tendrá color verde.

PRUEBA DE REDUCCION DEL NITRATO

Algunos microorganismos utilizan el nitrato en una vía alternativa como fuente de energía, reduciéndolo a nitrito o a nitrógeno libre. Esta propiedad es una característica importante en la diferenciación de muchos grupos bacterianos.

La presencia de nitrito en el medio se demuestra añadiendo alfa-naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un compuesto rojo: el parasulfobencenoazo-alfa-naftilamina.

Medio de cultivo

Se utiliza caldo nutritivo adicionado de nitrato potásico.

Fórmula en g/l de agua destilada:

Extracto de carne: 3 g.
Peptona: 5 g.
Nitrato potásico: 1 g.
pH: 7.

Preparar el medio y calentar hasta disolución. Distribuir en tubos a razón de 5 ml por tubo, y esterilizar en autoclave.

Reactivos

Reactivo A:

Alfa-naftilamina: 5 g.
Acido acético 5N al 30 por 100: 1.000 ml.

Reactivo B:

Acido sulfanílico: 8 g.
Acido acético 5N al 30 por 100: 1.000 ml.

Mantener los reactivos A y B en frasco oscuro y en nevera.

Inoculación

Realizar un inóculo denso en el caldo.

Incubación

Incubar a 35-37° C durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas.

Interpretación de los resultados

Añadir 0,5 ml de reactivo A y a continuación 0,5 ml del reactivo B. La aparición de un color rojo después de treinta segundos indica la presencia de nitritos en el medio.

La reducción de los nitratos puede dar otros productos más reducidos como amoniaco, nitrógeno molecular, óxido nítrico, óxido nitroso o hidroxilamina, dependiendo de la especie bacteriana, en tal caso, después de la adición del reactivo, no se aprecia cambio de color en el medio.

Para confirmar que el proceso es negativo es necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de zinc, el cual, en caso de que existan nitratos, los reducirá a nitritos, volviendo el medio de color rojo, e indicando consecuentemente que antes no se había producido la reacción. Si después de la adición del polvo de zinc el color no vira a rojo, indica que ha habido reducción y que el producto obtenido no ha sido el nitrito.

PRUEBA DE REDUCCION DE NITRATO PARA ANAEROBIOS

La prueba de reducción del nitrato para microorganismos anaerobios tiene el mismo fundamento y realización que el método descrito para aerobios, siendo el medio recomendado para realizar el ensayo el indol-nitrito y realizando la incubación del mismo, una vez inoculado, a 35-37° C en anaerobiosis, hasta que se observe un crecimiento abundante.

Medio Indol-nitrito


Fórmula en g/l de agua destilada:

Peptona trípsica de caseína: 20 g.
Fosfato disódico: 2 g.
Glucosa: 1 g.
Agar: 1 g.
Nitrato potásico: 1 g.
pH: 7,2.

Preparar el medio y calentar hasta disolución. Distribuir en tubos a razón de 5 ml en cada uno y esterilizar en autoclave.

Una vez fríos los tubos mantenerlos en ambiente anaeróbico durante un cierto tiempo. Si no se dispone de cámara anaeróbica se puede hervir el medio con los tapones aflojados, durante diez minutos, enfriar e inocular inmediatamente.

PRUEBA DE REDUCCION DE NITRATO PARA MICOBACTERIAS

El fundamento de esta prueba es el mismo que el ya descrito para otros microorganismos.

Medio de cultivo

Se utiliza una solución de nitrato:

Nitrato sódico: 0,425 g.
Tween 80: 4ml.
Agua destilada: 1.000 ml.

Reactivos

Se utiliza el reactivo A y el reactivo B descritos en la prueba para aerobios.

Inoculación

A partir de un cultivo joven, emulsionar un asa de colonias en un tubo de hemólisis con 2 ml de la solución de nitrato.

Incubación

Incubar a 35-37° C durante dos a cuatro horas.

Interpretación de los resultados

Añadir una gota del reactivo A y otra del reactivo B. La aparición de un color rosa-rojo en treinta-sesenta segundos, indica la presencia de nitritos en el medio. La prueba será negativa si no hay aparición de color.

Si no se ha producido coloración se debe confirmar que la prueba es negativa añadiendo una pequeña cantidad de polvo de zinc. Si se produce color rojo, la prueba es realmente negativa, pero si no hay cambio de color, la prueba será positiva, ya que los nitratos han sido reducidos a compuestos incoloros.

PRUEBA DE LA SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA

Los Staphylococcus coagulasa negativos pueden diferenciarse en dos grupos, según sean sensibles o no a la novobiocina
(5 µg).

Staphylococcus epidermidis es sensible, mientras que Staphylococcus saprophyticus no lo es.

Medio de cultivo

Se utiliza el mismo medio que el recomendado para la técnica del antibograma, es decir, el agar Mueller-Hinton.

Reactivo

Disco de novobiocina de 5 µg., que puede adquirirse comercializado.

Inoculación

Inocular superficialmente una placa de agar Mueller- Hinton con una suspensión de microorganismos de concentración análoga a la utilizada para los antibiogramas.

Dejar reposar quince minutos a temperatura ambiente y depositar en el centro de la placa un disco de novobiocina.

Incubación

Incubar a 35-37° C durante veinticuatro horas.

Interpretación de los resultados

Se considera al Staphylococcus sensible a la novobiocina cuando el halo de inhibición de crecimiento sea superior a 16 mm.

SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA

El clorhidrato de etilhidroxicupreína (optoquina) inhibe a muy baja concentración (5 µg/ml o menos) el crecimiento de Streptococcus pneumoniae, mientras que no afecta a otros Streptococcus alfa-hemolíticos o sus halos son inferiores a 15 mm.

Medio de cultivo

El medio de cultivo utilizado, es el agar-sangre de carnero al 5 por 100.

Reactivo


Disco de optoquina de 5 µg., que puede adquirirse comercialmente.

Inoculación


Empapar un hisopo con una suspensión del Streptococcus problema procedente de un cultivo de veinticuatro horas e inocular una placa de agar sangre, pasándolo bien por toda su superficie. Dejar reposar a temperatura ambiente durante diez minutos y añadir con unas pinzas estériles el disco de optoquina, presionándolo para favorecer su contacto con el medio. Hay autores que aconsejan añadir sobre el disco una gota de agua destilada estéril, pues con ello se favorece un aumento del halo de inhibición en unos 2 mm.

Incubación


Incubar a 35-37° C durante dieciocho-veinticuatro horas en una atmósfera enriquecida con un 2 a un 3 por 100 de C02. Los métodos que proporcionan un mayor aumento de C02 no son recomendables, pues pueden modificar el halo de inhibición.

Interpretación de los resultados

El crecimiento de Streptococcus pneumoniae queda inhibido en más de 15 mm alrededor del disco de optoquina. Los demás Streptococcus alfa-hemolíticos no presentan ningún tipo de inhibición o sus halos son inferiores a 15 mm.

Si la zona de inhibición es inferior a 15 mm, es aconsejable confirmar que es un neumococo con la prueba de solubilidad en bilis.

PRUEBA DE OXIDACION-FERMENTACION (O-F)

Pone de manifiesto la propiedad que tienen determinados microorganismos de actuar sobre los hidratos de carbono por vía oxidativa o fermentativa. Las bacterias que no presentan actividad sobre los glúcidos, dan esta prueba negativa.

Medio de cultivo

El utilizado es el medio básico de Hugh y Leifson.

Fórmula en g/l de agua destilada:


Peptona: 2 g.
Cloruro sódico: 5 g.
Fosfato dipotásico: 0,3 g.
Agar: 2,5 g.
Azul de bromotimol: 0,03 g.
pH: 7,1.

Una vez preparado y esterilizado el medio, dejar enfriar a unos 50° C y añadir en condiciones asépticas, 100 ml de una solución de glucosa (o del carbohidrato que se desee) al 10 por 100, previamente esterilizado por filtración. Repartir en tubos y dejar enfriar en posición vertical.

Separar los tubos en dos lotes y añadir superficialmente a todos los de un grupo, una capa de 1 cm de parafina líquida estéril.

Inoculación

Inocular por picadura hasta 1/2 cm del fondo del tubo. Para cada microorganismo se siembran dos tubos, uno de los cuales contiene parafina.

Incubación

Incubar a 35-37° C durante cuarenta y ocho horas o más.

Interpretación de los resultados


Los tubos se observan diariamente hasta los catorce días. El viraje de color azul verdoso a amarillo, indica que el microorganismo ha producido acidez a partir del azúcar. Si dicha coloración aparece solamente en el tubo que no está cubierto con parafina, diremos que el microorganismo actúa sobre la glucosa (o el azúcar utilizado) de forma oxidativa (0). Si se manifiesta en ambos, diremos que el germen es fermentativo (F).

PRUEBA DE LA OXIDASA

Pone de manifiesto la presencia de enzima oxidasa en ciertos microorganismos. La oxidasa o citocromooxidasa es una enzima que cede electrones (H2), de un substrato al oxígeno, en el tren de transporte electrónico.

Reactivo

Pueden utilizarse diversos reactivos, que son colorantes que actúan como aceptores de electrones, pasando en este caso de forma incolora o poco coloreada, a fuertemente teñida.

El reactivo más utilizado es el clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina al 1 por 100 en agua (reactivo de Kovacs).

Existen comercializados discos o tiras de papel impregnadas de reactivos para el diagnóstico de oxidasa.

Método

Colocar un trozo de papel de filtro Whatman núm. 1, dentro de una placa de Petri y añadirle dos-tres gotas de reactivo. Con un asa de platino (que no sea de hierro, ya que puede dar falsos positivos), coger una colonia de veinticuatro horas, y extenderla sobre el papel de filtro mojado.

Interpretación de los resultados

La aparición de una coloración púrpura sobre la línea de inoculación se considera como reacción positiva. Si no hay cambio de coloración, la prueba es negativa.

PRODUCCION DE PIGMENTOS

Esta prueba permite diferenciar especies de Pseudomonas al poner de manifiesto sus pigmentos específicos.

Medios de cultivo

Los medios utilizados son el King A (o P), y el King B (o F). El King A favorece la producción de piocianina y el King B la de fluoresceína.

Fórmula en g/l de agua destilada:

King A

Peptona de gelatina: 20 g.
Glicerol: 10 g.
Sulfato anhidro de potasio: 10 g.
Cloruro anhidro de magnesio: 1,4 g.
Agar: 15 g.
pH: 7,2.

King B

Proteosa peptona: 20 g.
Glicerol: 10 g.
Fosfato bipotásico anhidro: 1,5 g.
Sulfato de magnesio (7 H20): 1,5 g.
Agar: 15 g.

Preparar el medio, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave. Dejar enfriar en posici6n inclinada.

Inoculación

Con un cultivo joven sembrar, en el pico de flauta, los dos medios: el A y el B.

Incubación

Incubar a 30-32°C de uno a cinco días.

Interpretación de los resultados

King A

La presencia de una coloración azulada, se considera como positiva. Si posee otro color se debe confirmar la presencia de piocianina en la mezcla, extrayéndola con 0,5-1 ml de cloroformo. En caso positivo el disolvente se vuelve de color azul, y si se añaden unas gotas de HCI vira rápidamente a rojo.

King B

La presencia de fluoresceína se hace comprobando la fluorescencia (color verde manzana) bajo la lámpara de Wood, comparando con un tubo sin inocular.

PRODUCCION DE PIGMENTOS POR MICOBACTERIAS

La producción de pigmento es una prueba útil para la identificación de Micobacterias, ya que atendiendo a esta característica se pueden clasificar en tres grupos:

Primer grupo:
Micobacterias escotocromógenas. Son las que producen pigmento en presencia de luz y en la oscuridad, siendo normalmente más acentuado dicho pigmento en el primer caso.

Segundo caso: Micobacterias fotocromógenas. Sólo producen pigmento en presencia de luz.

Tercer grupo: Micobacterias no cromógenas. No producen pigmento con luz ni en la oscuridad.

Método

Exponer los cultivos desarrollados, en medio de Löwenstein, a la luz de una lámpara de 60 watios, a 50 ó 60 cm de distancia de la fuente luminosa, y con el tapón del tubo de cultivo aflojado para facilitar la oxigenación de las colonias. Mantener la exposición durante una hora.

Incubar de nuevo el cultivo de dieciocho a veinticuatro horas.

Utilizar como control un cultivo de la misma cepa envuelto en papel de aluminio, incubado en las mismas condiciones y que no haya tenido contacto alguno con la luz.

Interpretación de los resultados

Se considera la cepa como fotocromógena, cuando el cultivo mantenido en la oscuridad no presenta pigmentación y en cambio las colonias del tubo expuesto a la luz si la muestran, después de la posterior incubación de veinticuatro horas.

PRUEBA DE LA PIRAZINAMIDA (PZA)


Esta prueba pone de manifiesto la capacidad que tienen ciertas Micobacterias de producir la desaminación de la pirazinamida a ácido pirazinoico.

Medio de cultivo

Caldo base de Dubos: 1 l.
Pirazinamida: 0,1 g.
Piruvato s6dico: 2 g.
Agar: 15 g.

Dispensar en tubos a razón de 15 ml cada uno. Esterilizar en autoclave y dejar enfriar en posición vertical.

Caldo base de Dubos

Fórmula por l de agua destilada:


Casitona: 0,5 g.
Asparagina: 2 g.
Tween 80: 0,2 g.
Fosfato monopotásico: 1 g.
Fosfato disódico: 2,5 g.
Citrato amónico férrico: 50 mg.
Sulfato magnésico: 10 mg.
Cloruro cálcico: 0,5 mg.
Su Ifato de zinc: 0,1 mg.
Sulfato de cobre: 0,1 mg.
pH: 6,6.

Reactivo

Solución acuosa al 1 por 100 de sulfato férrico amónico.

Inoculación

A partir de un cultivo joven, realizar un inóculo abundante en dos tubos de medio.

Incubación


Incubar a 35-37° C durante cuatro días. Al cabo de este tiempo, añadir a uno de los tubos 1 ml de la solución acuosa de sulfato férrico amónico e incubar a 5° C durante cuatro horas.

Interpretación de los resultados

Se considera la prueba positiva si aparece color rosa sobre la superficie del agar, que pasado el tiempo, tiende a difundirse por todo el medio. La observación debe realizarse con luz incidente. Si la prueba es negativa, repetir al cabo de siete días con el otro tubo que habrá permanecido en incubación.





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